Studying the pharmacological safety of the standardized cleared bischofit brine

Full Text

Согласно разработанной в 2000 г. ГБУ ВМНЦ и ВолгГМУ программе «Российский магний» волгоградскими химиками-синтетиками получен очищенный от техногенных примесей стандартизированный рассол минерала бишофит [1]. Данный стандартизированный магнийсодержащий рассол бишофита, с успехом применяющийся в клинической практике в качестве бальнеологического средства, явился также основой для создания новых отечественных магнийсодержащих лекарственных препаратов, используемых для профилактики и лечения гипомагниемий различной этиологии. Доклиническими токсикологическими исследованиями показано наличие у данной формы СРБ при внутрижелудочном введении крысам более низкой, нежели у неочищенной формы, токсичности, отсутсвие кумулирующих и аллергенных свойств [2].

В настоящей работе сочли целесообразным исследовать фармакологическую безопасность очищенной формы СРБ при 90-дневном внутрижелудочном введении крысам.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Исследовать доклиническую фармакологическую безопасность стандартизированного рассола минерала бишофит при повторном внутрижелудочном введении крысам в течение 90 дней и 30 дней его отмены.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено в соответствии с требованиями действующего Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств под ред. Миронова А.Н. [3], со статьей 11 Федерального закона от 12 апреля 2010 г. № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2010, № 16, ст. 1815; № 31, ст. 4161) и согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (Национальный стандарт Российской федерации ГОСТ Р 53434-2009).

Эксперименты проведены на белых аутобредных крысах самцах и самках 3–3,5-месячного возраста с исходной массой тела 180–225 г, доставленных из Питомника Филиала ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА» России «Андреевка», Московской области.

После доставки из специализированного питомника животные в течение 2 недель находились на карантинном режиме с ежедневным ветеринарным осмотром. Содержание животных осуществлялось в соответстветствии с постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29.08.2014 № 51 «Об утверждении СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», и правил, принятых Европейским парламентом и советом Европейского союза по охране животных, используемых в научных целей (Директива 2010/63/EEC).

По истечении карантина животных перемещали в экспериментальный отсек, где проводили 7-дневную адаптацию и распределение по группам. Состояние здоровья в период адаптации ежедневно оценивали по внешнему виду и проявлению клинических признаков заболевания путем визуального осмотра в группах. Животных с обнаруженными в ходе осмотра отклонениями в экспериментальные группы не включали. Распределение по исследуемым группам (контрольная и опытная группы) проводили с учетом массы тела в пределах средних значений ±20 %.

Тестируемый стандартизированный рассол минерала бишофит (СРБ) вводили опытной группе крыс внутрижелудочно ежедневно курсом 90 дней в форме раствора на дистиллированной воде в дозе 0,01 мл/кг (экспериментально доказанная терапевтическая доза). Контрольной группе крыс вводили внутрижелудочно дистиллированную воду в дозе 5 мл/кг.

В период эксперимента исследовали: общее состояние, массу тела, поведенческую активность, электрофизиологическую активность миокарда, периферическую кровь, биохимические показатели плазмы крови, функциональное состояние печени и почек. Также, по окончанию 3-месячного курса введения и 1 месяца отмены проводили патоморфологические исследования.

Динамику прироста массы тела оценивали еженедельно. Вес тела отмечали в граммах, прирост – в процентах. По окончании трехмесячного периода введения СРБ и через 1 месяц после его отмены введения исследовали: поведенческую активность в тесте «открытое поле» [4] (учитывали количество пересеченных квадратов, вертикальных стоек, заглядываний в напольные отверстия, акты груминга и дефекаций); периферическую кровь – по количеству эритроцитов (1 × 10¹²/л), лейкоцитов (1 × 10⁹/л), тромбоцитов (1 × 10⁹/л) и уровню гемоглобина (г/л), измеряемых на анализаторе гематологическом MicroCC 20Plus (США), скорости оседания эритроцитов (мм/ч), цветовому показателю эритроцитов (у. е.), времени (с) свертывания крови по методу Мас-Магро [5].

В окрашенных по методу Романовского [5] мазках крови подсчитывали лейкоформулу (соотношение форменных элементов в лейкоформуле выражали в %). При биохимическом исследовании плазмы крови крыс [4] определяли уровни глюкозы (ферментативный метод), трансаминаз (метод Райтмана в реакции с 2,4-динитрофенилгидразином), мочевины (диацетилмоноксимный метод), креатинина (цветная реакция с пикриновой кислотой), общего холестерина (ферментативный метод), общего белка (биуретовая реакция), щелочной фосфатазы (метод постоянного времени по цветной реакции с 4-нитрофенолом) с использованием наборов BIO-LA-TEST (Чехия, Erba Lachema s.r.o.). Интенсивность окраски изучаемых показателей измеряли на цифровом спектрофотометре PD-303UV (Apel, Япония) при длине волны 420–540 нм в кювете толщиной 1 см. Об электрофизиологической активности миокарда судили по электрокардиограмме крыс [4], записанной на трехканальном электрокардиографе ЭК3Т-02 «АКСИОН» (Ижевск, Россия). Регистрировали изменения интервалов «R-R» (с), «QRS» (с), амплитуду зубца «R» (мВ). По интервалу «R-R» рассчитывали частоту сердечных сокращений (уд./мин). Функциональное состояние печени (ее поглотительно-выделительную и детоксицирующую функцию) оценивали в нагрузочном тесте с красителем бромсульфалеином (SIGMA – ALDRICH, Германия) [6]. Экскреторную функциональную активность почек исследовали в нагрузочном тесте с красителем «феноловый красный» [7]. Патоморфологические исследования проводили по общепринятым методам эвтаназии и некропсии животных [8, 9].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel. Значимость различий количественных признаков оценивали с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В наблюдениях за общим состоянием животных, получавших ежедневно в течение 90 дней СРБ, существенных различий с контролем не зафиксировано. Состояние и опрятность шерстного покрова, видимых слизистых в исследуемых группах «Опыт» и «Контроль» не различались. Динамика массы тела животных была положительной. При этом относительно группы «Контроль» у крыс самцов опытной группы прослеживалась статистически незначимая тенденция меньшего прироста массы тела (в среднем 5,5 %; р > 0,05), тогда как у крыс самок различий с контролем не обнаружено. После отмены введения СРБ, прирост массы тела и у самцов, и у самок в опытной и контрольной группах не различался.

Незначительные половые различия выявлены и при тестировании поведенческой активности крыс. Так, относительно группы «Контроль» у самцов крыс в опытной группе прослеживалось повышение количества вертикальных стоек на 68,8 % (p > 0,05) и заглядываний в напольные отверстия на 16,7 % (p > 0,05), при снижении количества актов груминга на 53,6 % (p > 0,05) и повышении числа актов дефекаций на 18,9 % (p > 0,05). У крыс самок в опытной группе прослеживалось снижение горизонтальной активности на 22,4 % (р > 0,05), вертикальных стоек на 66,2 % (p < 0,001), эмоциональная активность снижалась несущественно. Выявляемые изменения в поведенческой активности животных, получавших СРБ трехмесячным курсом, были полность нивелированы до уровня контрольных значений после одного месяца отмены его введения.

Половые различия в действии СРБ также обнаруживались и в исследованиях по оценке электрофизиологической активности сердца (табл. 1).

Так, у самцов в опытной группе прослеживалось наличие статистически достоверного повышения частоты сердечных сокращений на 11,0 % (p < 0,01), при укорочении интервала «R-R» на 12,0% (p < 0,001) и повышении амплитуды зубца «R» в 2 раза (p > 0,05). Данные изменения не выходили за рамки физиологических норм и полностью нивелировались до состояния контроля через один месяц отмены введения самцам препарата СРБ. У самок же в опытной группе по сравнению с контролем существенных различий в исследуемых показателях не выявлялось.

 

Таблица 1 Влияние СРБ (внутрижелудочно, 3 месяца) на электрокардиограмму крыс (M ± m)

Исследуемые параметры	Контрольная группа, дистиллированная вода 5 мл/кг	Опытная група, СРБ 0,01 мл/кг	Контрольная группа, дистиллированная вода 5 мл/кг	Опытная группа, СРБ 0,01 мл/кг
	самцы		самки
ЧСС, уд./мин	354,0 ± 3,0	392,70 ± 4,06*	387,30 ± 6,32	393,00 ± 6,66
R, мВ	0,20 ± 0,03	0,40 ± 0,01	0,30 ± 0,02	0,30 ± 0,05
R-R, с	0,170 ± 0,002	0,150 ± 0,002**	0,15 ± 0,01	0,15 ± 0,003
QRS, с	0,030 ± 0,005	0,020 ± 0,004	0,030 ± 0,003	0,30 ± 0,003

*p < 0,01; **p < 0,001 различия достоверны по сравнению с интактным контролем.

 

В гематологических исследованиях значительных изменений в периферической крови крыс самцов и самок не зафиксировано, как на период окончания 3 месяцев введения препарата СРБ, так и на период его отмены. В биохимических показателях плазмы крови крыс исследуемых групп существенных различий также не обнаружено. Однако у крыс самцов в группе опыт относительно группы контроля выявлялась статистически незначимая тенденция повышения уровня глюкозы на 25,5 % (р > 0,05) и снижения уровня щелочной фосфотазы на 31,3 % (р > 0,05). Данные изменения полностью нивелировались до контрольных значений после отмены введения СРБ, что свидетельствует об их обратимости и отсутствии повреждающего действия.

При оценке влияния препарата СРБ на поглотительно-выделительную функцию печени по окончанию 3 месяцев введения СРБ и после его отмены существенных изменений не обнаружено. При оценке же реабсорбирующей функции почек выявлено, что по сравнению с группой контроля у крыс самцов опытной группы количество выделяемой мочи повышалось на 9,6 % (p > 0,05), а количество выделяемого с мочой красителя на 60,0 % (p > 0,05). У крыс самок в опытной группе количество выделяемой мочи увеличивалось на 38,5 % (p < 0,01), а количество выделяемого с мочой красителя на 84,6 % (p < 0,01). В исследованиях, проведенных через один месяц после отмены введения СРБ, прослеживались эффекты реабилитации экскреторной и реабсорбирующей функций почек крыс как у самцов, так и у самок (табл. 2).

 

Таблица 2 Влияние СРБ на выделительную функцию почек у крыс (проба с феноловым красным) (М ± m)

Исследуемые параметры	Контрольная группа, дистиллированная вода 5 мл/кг	Опытная группа, СРБ 0,01 мл/кг	Контрольная группа, дистиллированная вода 5 мл/кг	Опытная группа, СРБ 0,01 мл/кг
	самцы		самки
3 месяца отмены
Количество мочи, мл	7,30 ± 0,14	8,0 ± 0,2	3,90 ± 0,28	5,40 ± 0,18*
Количество краски, мг	1,00 ± 0,02	1,60 ± 0,59	1,30 ± 0,05	2,40 ± 0,14*
1 месяц отмены
Количество мочи, мл	5,50 ± 0,06	6,00 ± 0,35	2,60 ± 0,12	2,90 ± 0,09
Количество краски, мг	2,80 ± 0,04	2,70 ± 0,09	0,60 ± 0,01	0,50 ± 0,13

*p < 0,01 различия достоверны по сравнению с интактным контролем.

 

По результатами патоморфологических исследований, проведенных после эвтаназии и аутопсии животных, существенных изменений при макроскопическом и микроскопическом обследовании внутренних органов у животных не обнаружено. Коэффициенты масс исследуемых органов в опытных группах самок и самцов не различались с группой контроля.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании проведенных исследований по изучению фармакологической безопасности СРБ можно сделать заключение, что при внутрижелудочном трехмесячном повторном введении препарат в дозе 0,01 мл/кг не оказывает повреждающего влияния на интегральные показатели общего состояния крыс, поведенческую активность, электрофизиологическую активность миокарда, периферическую кровь, биохимические показатели плазмы крови, функции печени и почек, на состояние и морфоструктуру внутренних органов. Выявляемые эффекты половых различий в действии СРБ на поведенческую активность (повышение двигательной и эмоциональной активности у самцов и снижение таковых эффектов у самок), электрокардиограмму (повышение ЧСС и амплитуды зубца «R» у самцов и отсутствия изменений у самок), биохимические показатели (увеличение уровня глюкозы у самцов и отсутсвия изменений у самок) могут свидетельствовать о наличии тенденции активирующего влияния СРБ в целом на самцов крыс. Вместе с тем данные эффекты не выходили за рамки физиологической нормы и полностью нивелировались до состояния контроля в период отмены введения стандартизированного рассола бишофит, что может свидетельствовать лишь о транзиторном действии препарата на отдельные гомеостатические показатели с обратимым действием.

About the authors

Lyubov I. Bugaeva

Volgograd State Medical University; Volgograd Medical Research Center

Author for correspondence.
Email: li_bugaeva@mail.ru

Doctor of Biological Sciences, Head of the Toxicology Laboratory

Russian Federation, Volgograd; Volgograd

Alexander A. Spasov

Volgograd State Medical University

Email: aspasov@mail.ru

Academician, Honored Scientist, Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Department of Pharmacology and Bioinformatics

Russian Federation, Volgograd

Svetlana A. Lebedeva

Volgograd State Medical University; Volgograd Medical Research Center

Email: lebedeva.farm@mail.ru

Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, Laboratory for the Synthesis of Innovative Medicines

Russian Federation, Volgograd

Tatyana M. Korzhova

Volgograd State Medical University; Volgograd Medical Research Center

Email: bundikova1@mail.ru
Russian Federation, Volgograd; Volgograd

Andrey Yu. Getmanenko

мVolgograd State Medical University; Volgograd Medical Research Center

Email: dustgod@mail.ru

Researcher at the Laboratory of Toxicology

Russian Federation, Volgograd; Volgograd

References

Supplementary files