Prospects for the application of angiopoetin-like proteins type 3 and 4 for early and accurate diagnosis of kidney damage

Full Text

Концепция нефротоксичности липидов была впервые предложена в 1982 году. Липиды играют важную роль не только в повреждении клубочков, но и в тубулоинтерстициальном повреждении, которое может вызывать утолщение базальной мембраны клубочков и вызвать развитие интерстициального фиброза почек [1]. Однако механизм повреждения почек, вызванного гиперлипидемией, понятен не до конца.

Триглицериды (ТГ) в липопротеиновых частицах выводятся из кровотока под действием липопротеинлипазы (ЛПЛ) [2]. Активность ЛПЛ в первую очередь контролируется на посттрансляционном уровне с участием ключевых факторов, включающих жирные кислоты, которые ингибируют ЛПЛ и аполипопротеины C1, C2, C3 и A5. Наряду с этим активность ЛПЛ регулируется тремя (из восьми известных в настоящее время) членами семейства ангиопоэтин-подобных белков [3].

Ангиопоэтиноподобные белки (Angiopoietin-like proteins, ANGPTLs) структурно схожи с ангиопоэтинами, однако, в отличие от ангиопоэтина, они не связываются с эндотелиальными тирозинкиназными рецепторами (TIE1 – тирозинкиназа с иммуноглобулиноподобным и ЭФР-подобным доменом 1 и TIE2 – тирозинкиназа с эндотелиально-специфическим рецептором), чтобы индуцировать ангиогенез [4, 5], и не имеют идентифицированных родственных рецепторов. Подобно ангиопоэтинам, ANGPTLs содержат сигнальный пептид из 16 аминокислот, N-концевой спиральный домен (nANGPTL), линкерную область и С-концевой фибриноген-подобный домен (cANGPTL). Посттранскрипционное протеолитическое расщепление свойственно для ANGPTL 3-го и 4-го типов (см. рис.). Полноразмерные ANGPTL и N-концевые расщепленные фрагменты могут образовывать олигомеры, в то время как C-концевые расщепленные фрагменты высвобождаются в виде мономеров [6]. Расщепление и олигомеризация облегчают функционирование АППБ.

 

Рис. Структура ANGPTL 3-го и 4-го типов (уровни протеолитического расщепления обозначены пунктиром): 1 – N-концевой спиральный домен; 2, 4, 6, 8 – неизвестные доменные структуры; 3 – участок, специфичный для ЛПЛ; 5 – линкерная область (coiled-coil domain); 7 – С-концевой фибриноген-подобный домен

 

Ангиопоэтин-подобный белок 3-го типа (Angio-poietin-like protein 3, ANGPTL3) – гликопротеин с молекулярной массой 70 кДа, содержит 460 аминокислот (см. рис.), продуцируется печенью и является основным регулятором метаболизма липопротеинов [5, 7], в первую очередь, за счет ингибирования активности ЛПЛ, а также эндотелиальной липазы, что приводит к замедлению метаболизма липопротеинов, богатых ТГ [8, 9]. ANGPTL3 был обнаружен в сыворотке в двух формах – в виде полноразмерного белка и в виде расщепленной N-концевой молекулы, причем расщепление ANGPTL3 в линкерной области может происходить как внутриклеточно, так и внеклеточно. С-концевой фибриноген-подобный домен может связываться с рецептором интегрина ανβ3, облегчая прогрессирование ангиогенеза [10]. N-концевой домен представляет собой часть, ответственную за ингибирующую активность в отношении ЛПЛ, причем укороченная после расщепления форма ANGPTL3 проявляет более высокую ингибирующую активность как изолировано, так и в комплексе с ангиопоэтин-подобным белком 8 типа [5, 11, 12].

Ангиопоэтин подобный белок четвертого типа (Angiopoietin-like protein 4, ANGPTL4) был идентифицирован как транскрипционная мишень PPAR (Peroxisome proliferator-activated receptor) в метаболических тканях (таких как печень и жировая ткань) и представляет собой олигомер, состоящий из 406 аминокислот с молекулярной массой ≈ 65 кДа (см. рис.) и содержащий межмолекулярные дисульфидные связи [13]. ANGPTL4 – гликопротеин, секретируемый главным образом печенью, – может расщепляться под действием пропротеинконвертаз на два активных пептида [14, 15] и участвует в различных физиологических процессах [16] и заболеваниях (ожирение, диабет, атеросклероз и др.) [17]. Нативный и нерасщепленный ANGPTL4 и N-концевой домен (nANGPTL4) регулируют энергетический гомеостаз и липидный состав [18], являясь эффективными ингибиторами активности ЛПЛ (в процессе гидролиза ТГ плазмы до свободных жирных кислот) [3, 19], что ведет к увеличению концентрации циркулирующих ТГ и, следовательно, оказывает влияние на развитие метаболических нарушений.

Функциональные исследования in vitro показали, что ANGPTL3 обратимо ингибирует, а ANGPTL4 необратимо ингибирует ЛПЛ. Биологическое объяснение разницы между ассоциациями уровней ANGPTL3 и ANGPTL4 с липидными признаками неочевидно. Их механизмы ингибирования ЛПЛ различны [20]. ANGPTL3 ингибирует эндотелиальную липазу, а ANGPTL4 – преимущественно липазу печени, и, хотя неясно, существуют ли четкие качественные различия между двумя белками, это может дать некоторое объяснение. Следует отметить, что их аминокислотная последовательность значительно варьируется, и существует только 30 % сходства между двумя белками [21]. Они различаются по экспрессии в тканях, причем ANGPTL4 более широко экспрессируется, в том числе в кишечнике и жировой ткани, тогда как ANGPTL3 более специфичен для печени. Наконец, регуляция экспрессии отличается: ANGPTL3 более чувствителен к X-рецептору печени (LXR), а ANGPTL4 – к PPARα (Peroxisome proliferator-activated receptor). Наконец, важное различие между этими двумя белками состоит в том, что ANGPTL3 ингибирует ЛПЛ через эндокринный путь, а действие ANGPTL4 на ЛПЛ может происходить через аутокринные пути и локальные паракринные пути.

Исследования последних лет (в экспериментах с участием человека и/или мыши) показали, что ANGPTL3 и ANGPTL4 (в большей степени) экспрессируются также и в подоцитах почек [6], что представляет, по нашему мнению, интерес в плане изучения механизмов возникновения и прогрессирования почечной дисфункции, а также поиска возможных новых биомаркеров почечного повреждения.

После предположения, что гиперлипидемия может вызывать заболевание почек и ускорять развитие гломерулярного склероза и почечного интерстициального фиброза, гипотеза «нефротоксичности липидов» позволила по-новому взглянуть на механизмы, лежащие в основе повреждения почек и последующей протеинурии [22], причем появились убедительные доказательства того, что почки сами могут являться источником секреции липопротеинов [23].

ANGPTL3 способен эндогенно продуцироваться не только в печени, как было установлено ранее, но и в почках [24, 25]. Liu J. и соавт. обнаружили, что гломерулярные подоциты могут синтезировать ANGPTL3, а уровень его экспрессии положительно коррелирует со степенью протеинурии и слияния отростков подоцитов [26]. По мнению Li G. и соавт., ANGPTL3 может играть роль в механизме повреждения подоцитов, связанного с гиперлипидемией, через α-актинин-4 [27]. В свою очередь Lin Y. и соавт. утверждают, что ANGPTL3, связываясь с рецептором интегрина β3 на поверхности подоцитов, может активировать сигнальный путь PI3K/ACTN4 с последующей перестройкой цитоскелета и увеличением активности подоцитов [28]. Перестройка цитоскелетного актина, являющегося молекулярной основой подвижности подоцитов, приводит к ослаблению соединения подоцитов и потери адгезии подоцитов [29], что является патологической основой гломерулосклероза.

Гиперлипидемия, являясь важным маркером прогрессирования хронической болезни почек (ХБП), существенно усугубляет почечные повреждения. ANGPTL3 является ключевой молекулой в развитии нефротической протеинурии, так как активно участвует в повреждении гломерулярных подоцитов. В исследовании Gao X. и соавт. по изучению изменений уровня ANGPTL3 у пациентов с гиперлипидемией в зависимости от выраженности протеинурии было показано, что ANGPTL3 заметно повышается при нарастании протеинурии, связанной с гиперлипидемией, и может быть вовлечен в процесс повреждения подоцитов [30].

У пациентов с нефротическим синдромом (НС) наблюдается резкое увеличение ANGPTL3 в подоцитах почек [31]. А ряд исследователей показали, что снижение экспрессии ANGPTL3 защищает структуру и функцию почек в животных моделях нефротического синдрома, снижает протеинурию и гиперлипидемию [26, 32, 33]. Wen F. и соавт. представили доказательства того, что уровень ANGPTL3 (в сыворотке и моче) повышался у детей с НС, коррелировал со степенью протеинурии и был ценным маркером для оценки тяжести заболевания [34]. В исследовании Zhong F. и соавт. изучалось влияние ANGPTL3 на дислипидемию во время развития первичного НС. Сывороточный уровень AППБ3 у пациентов с первичным НС был значительно повышен (р < 0,001, по сравнению с группой здоровых лиц), также были выявлены значимые корреляции между уровнем ANGPTL3 в сыворотке и уровнями холестерина, ТГ и липопротеидов низкой плотности. Авторы предложили к рассмотрению общий патогенетический механизм, объясняющий одновременное развитие патофизиологических феноменов (массивная протеинурия и гиперлипидемия) при первичном НС, с участием ANGPTL3 посредством ингибирования экспрессии ЛПЛ [31].

Наряду с этим, многочисленные исследования показали, что уровни ANGPTL3 в сыворотке были значительно повышены у пациентов с диабетической нефропатией (ДН), что положительно коррелировало с уровнем отношения микроальбумина к креатинину в моче и отрицательно коррелировало с расчетной скоростью клубочковой фильтрации (рСКФ) [35, 36]. В недавно проведенном исследовании Azadi S.M. и соавт. также сообщили о связи ANGPTL3 с почечной дисфункцией и гипертриглицеридемией у пациентов с ДН [37].

Восстановление функции подоцитов и снижение протеинурии, в том числе и при ДН, было предложено осуществить посредством ингибирования ANGPTL3. Для этих целей было создано моноклональное антитело против ANGPTL3-FLD (анти-ANGPTL3), которое конкурентно блокировало (у мышей) связывание ANGPTL3 с интегрином αvβ3, тем самым ингибируя повреждение подоцитов и ослабляя протеинурию. Позднее был протестирован бифункциональный слитый белок (анти-ANGPTL3/IL22), образованный путем слияния интерлейкина-22 (IL-22) с С-концом антитела против ANGPTL3, нефропротекторный эффект которого был обусловлен блокадой пути NF-kB/NLRP3. Данный гибридный белок анти-ANGPTL3/IL22 продемонстрировал отличную стабильность, обладал способностью лечить ДН (у мышей) за счет уменьшения повреждения подоцитов, подавления воспаления и стимулирования регенерации тканей, что, по мнению авторов, может стать обнадеживающим терапевтическим подходом при лечении данного заболевания у человека [38]. Созданное Han X. и соавт. поликлональное антитело против С-домена ANGPTL3 положительно влияло на протеинурию и дисфункцию подоцитов при адриамицин-индуцированной нефропатии у мышей [39]. Нокаут ANGPTL3 значительно облегчал почечную дисфункцию и апоптоз подоцитов у мышей при индуцированной липополисахаридном острой почечной недостаточности [40], демонстрируя потенциал защитного действия на повреждение почек при нефропатии. Lv Q. и соавт. тоже разработали моноклональное антитело против последовательности ANGPTL3-FLD человека (5E5F6) для ингибирования связывания ANGPTL3-FLD с интегрином β3, использование которого в мышиной модели приводило к уменьшению протеинурии, значительному снижению апоптоза подоцитов и активных форм кислорода, а также улучшению фрагментации и дисфункции митохондрий. Лечение данными моноклональными антителами восстанавливало повреждения подоцитов, нормализовало альбуминурию и метаболические нарушения у мышей с адриамицин-индуцированной нефропатией, что подтверждает обоснованность нацеливания на ANGPTL3 в терапевтическом подходе при заболеваниях почек с НС [41].

Длительная и значительная протеинурия тесно связана с прогрессирующим снижением функции почек [42]. Повреждение подоцитов играет центральную роль в протеинурии и дисфункции почек, поэтому очень желательно определение конкретного биомаркера для оценки более раннего повреждения подоцитов.

Секретируемый подоцитами ANGPTL4 опосредует протеинурию при различных типах подоцитопатии. Гипосиалилированный (без остатков сиаловой кислоты) ANGPTL4, секретируемый гломерулярными подоцитами, играет важную роль в формировании протеинурии. По данным Gao Y. и соавт. повышенная экспрессия ANGPTL4 вовлечена в процессы диабетического повреждения почек и пироптоза подоцитов у мышей [43]. Herman-Edelstein M и соавт. продемонстрировали заметное накопление липидов в почечной ткани у пациентов с диабетом и обнаружили повышенную экспрессию ANGPTL4 в биоптатах почек пациентов с диагностированной ДН, что может способствовать гипертриглицеридемии в сыворотке и играть важную роль в прогрессировании почечной недостаточности [44]. В исследовании Bano G. и соавт. было продемонстрировано, что при ДН концентрация ANGPTL4 в моче была повышена у пациентов с макроальбуминурией по сравнению с пациентами в группе с нормоальбуминурией и, более того, уровни ANGPTL4 повышались при ухудшении функции почек (отрицательная корреляция с рСКФ указывала на снижение почечной функции при избыточной экспрессии ANGPTL4 в моче) [45]. Клиническое исследование, проведенное Vanarsa K. и соавт., показало, что ANGPTL4 коррелирует с хроническим заболеванием почек и может действовать как универсальный маркер снижения функции почек [46]. В нашем раннем исследовании также были выявлены отрицательные корреляции средней силы между показателями рСКФ по формуле CKD-EPI 2009 года и уровнем ANGPTL3 (r = -0,32, р < 0,001) и ANGPTL4 (r = -0,31, р < 0,001) у больных ревматоидным артритом [47].

AППБ4, секретируемый подоцитами в кровоток, был предложен как механизм гипертриглицеридемии при нефротическом синдроме [48]. Однако позже было установлено, что ANGPTL4 в моче секретируется подоцитами независимо от уровня данного белка в крови, так как уникальная форма AППБ4, секретируемая подоцитами, не способна проникать в кровоток [49]. Отсутствие корреляции между уровнями AППБ4 в моче и сыворотке, описанное Gao X. и соавт. у пациентов с протеинурией, связанной с гиперлипидемией, может быть объяснено различными источниками ANGPTL4 в моче и сывороточного ANGPTL4, который в основном секретируется периферическими скелетными мышцами и жировой тканью. Примечательно, что у пациентов с гиперхолестеринемией уровень ANGPTL4 в моче был в большей степени связан с прогрессированием почечного повреждения и указывал на степень протеинурии, а содержание ANGPTL4 в сыворотке было в значительной степени связано с уровнями липидов в крови [50]. Видимо в будущих исследованиях ANGPTL4 в сыворотке и моче следует рассматривать как независимые объекты.

У пациентов на хроническом гемодиализе уровни ANGPTL4 в сыворотке были значительно повышены при терминальной стадии почечной недостаточности и независимо связаны с маркерами почечной функции, такими как креатинин сыворотки и рСКФ, у лиц в контрольной группе [51]. В более поздней работе авторы наблюдали рост уровней ANGPTL4 во время гемодиализа и постепенное его снижение через 180 мин после завершения процедуры [52].

Несмотря на широкое внимание к взаимосвязи между дислипидемией и хронической болезнью почек в течение десятилетий, механизм гиперлипидемии, приводящей к ХБП, до сих пор не выяснен. Клиницистам по-прежнему не хватает препаратов молекулярно-таргетной терапии для предотвращения повреждений почек при гиперлипидемии. Новые стратегии лечения гломерулярных заболеваний и замедления прогрессирования ХБП, связанной с протеинурией, можно в целом разделить на две категории: первая включает введение новых терапевтических агентов, а вторая – истощение циркулирующего патогенного белка. Рекомбинантный ANGPTL4 в высшей степени подходит для разработки в качестве биологического терапевтического агента при протеинурических расстройствах [53], поскольку он естественным образом образует олигомеры очень высокого порядка (гликозилированный мономер 65–70 кДа) с эффективным размером, большим, чем самые крупные белки плазмы [54, 55]. К сожалению, хотя использование моноклональных антитела против ANGPTL4 у мышей и обезьян приводило к снижению выраженности атеросклеротических процессов, однако прогрессирующее развитие тяжелого клинического фенотипа у этих животных исключает использование данных антител в настоящее время у людей.

Во всем мире растет число людей с нарушением функции почек вследствие ХБП. О степени снижения почечной функции можно судить, в первую очередь, по изменению рСКФ. К сожалению, на ранней стадии ХБП, пока не возникнет серьезное повреждение почек, явные клинические симптомы отсутствуют. Раннее выявление, диагностика и лечение важны для предотвращения прогрессирования заболевания, поскольку прогрессирование ХБП связано со многими неблагоприятными исходами, включая терминальную стадию заболевания почек, сердечно-сосудистые заболевания и повышенную смертность. Недостаток чувствительных и специфических маркеров для диагностики и лечения ХБП указывает на необходимость срочной идентификации новых биомаркеров [56].

About the authors

V. A. Aleksandrov

Volgograd State Medical University; Research Institute of Clinical and Experimental Rheumatology named after А.B. Zborovsky

Author for correspondence.
Email: imlab@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4500-7172

Assistant of the Department of Hospital Therapy, Volgograd State Medical University; Junior Research Associate, Research Institute of Clinical and Experimental Rheumatology named after А.B. Zborovsky

Russian Federation, Volgograd; Volgograd

References

Supplementary files