Characteristics of morphological and ultrastructural transformationof the cornea after UV crosslinking (literature review)

Mukharram M. Bikbov; Бикбов Мухаррам Мухтарамович; Akhzat R. Khalimov; Халимов Ахзат Рашидович; Natalia E. Shevchuk; Шевчук Наталья Евгеньевна; Gulli M. Kazakbayeva; Казакбаева Гюлли Мухаррамовна; Leisan I. Gilemzyanova; Гилемзянова Лейсан Ильшатовна; Iskander D. Valishin; Валишин Искандер Дамирович

doi:10.19163/1994-9480-2025-22-2-13-20

Характеристика морфологической и ультраструктурной трансформации роговицы после УФ кросслинкинга (обзор литературы)

Авторы: Бикбов М.М.¹, Халимов А.Р.¹, Шевчук Н.Е.¹, Казакбаева Г.М.¹, Гилемзянова Л.И.¹, Валишин И.Д.¹
Учреждения:
1. Башкирский государственный медицинский университет
Выпуск: Том 22, № 2 (2025)
Страницы: 13-20
Раздел: Обзорные статьи
URL: https://journals.eco-vector.com/1994-9480/article/view/642380
DOI: https://doi.org/10.19163/1994-9480-2025-22-2-13-20
ID: 642380

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

В статье представлены краткие сведения по экспериментальному и клиническому изучению морфологической и ультраструктурной трансформации роговицы, наблюдаемой после ультрафиолетового (УФ) кросслинкинга (сшивания) роговичного коллагена. В обзор включены результаты, полученные на основе современных методов исследования. Показано, что УФ кросслинкинг индуцирует в роговице в раннем послеоперационном периоде (1 мес.) характерный отклик, связанный с очаговым разволокнением коллагена стромы, изменением межфибриллярного расстояния, увеличением диаметра фибрилл, утратой поверхностных нервных волокон, активацией апоптоза кератоцитов со снижением их количества. Выявленные особенности носят транзиторный характер (до 6 мес.) и затрагивают преимущественно переднюю и среднюю строму, не влияя на эндотелий роговицы. В срок 6–12 мес. отмечается восстановление корнеальных нервных волокон, репопуляция кератоцитов, упорядочивание нарушенной межфибриллярной последовательности, уплотнение коллагеновой структуры с сохранением жесткости роговицы, в том числе за счет увеличения диаметра фибрилл коллагена. Положительный кросслинкинг-индуцированный эффект более выражен на фоне патологически измененной роговицы, в частности, при кератоконусе, по сравнению с экспериментальными моделями УФ кросслинкинга, воспроизведенными на интактных лабораторных животных.

Ключевые слова

ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы, морфология роговицы, кератоконус

Полный текст

Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы (CXL), применяемый в клинической практике два последних десятилетия, произвел революцию в лечении кератоконуса. Было продемонстрировано, что воздействие ультрафиолетового (УФ) излучения диапазона А в комбинации с рибофлавином способствует повышению биомеханики биологических тканей, в частности роговицы [1]. В настоящее время CXL является признанным и достаточно безопасным методом лечения прогрессирующего кератоконуса и ряда других дегенеративных и воспалительных заболеваний роговой оболочки [2].

Процесс CXL представляет собой фотохимические взаимодействия, опосредованные участием УФ излучения длиной волны (370 ± 5) нм и рибофлавина (витамин В₂). Последний выполняет функцию фотосенсибилизатора, который под воздействием ультрафиолета продуцирует активные формы кислорода (АФК), инициирующие образование ковалентных связей между молекулами коллагена, белками межламеллярной адгезии. Форми-рование дополнительных химических связей может происходить между аминоконцами боковых цепей коллагена и протеогликанами внеклеточного матрикса с генерацией синглетного кислорода [3, 4. 5]. Таким образом, процесс УФ «сшивки» коллагена роговицы с участием фотоактивированного рибофлавина и АФК приводит к укреплению структуры роговицы и приостанавливает прогрессирование кератэктазии.

Проведенные многочисленные исследования доказали безопасность CXL. Серьезные осложнения, развивающиеся при использовании данной методики, достаточно редки и включают помутнение роговицы, значительно реже рубцевание или послеоперационные инфекции, а в единичных случаях повреждение эндотелия. Кроме этого, были отмечены реактивация герпетических инфекций и стерильные инфильтраты стромы роговицы [6].

Кросслинкинг роговицы активно применяется при лечении пациентов с кератэктазиями, которые являются хроническими, невоспалительными, дегенеративными заболеваниями роговицы и характеризуются структурной дезорганизацией роговичного коллагена, значительным ослаблением внутри- и межфибриллярных связей, что приводит к прогрессирующему снижению зрительных функций. Известно, что среди первичных кератэктазий в подавляющем большинстве случаев (более 98 %) встречается кератоконус (КК) [7].

Известны традиционные ранние клинические проявления CXL – это роговичный синдром, вызванный деэпителизацией роговой оболочки (до 4 сут.), отек стромы (до 7 сут.) и псевдохейз (помутнение) роговицы (до 1–3 мес.). Несмотря на достаточно большое число работ, посвященных результатам применения CXL в лечении пациентов с КК, исследователей по-прежнему интересует, какие именно морфологические и ультраструктурные изменения происходят в роговице после ее УФ облучения в присутствии рибофлавина [8, 9, 10].

Исследования микроструктуры роговицы после CXL указывают на изменения в размере и последовательности коллагеновых фибрилл, при этом наиболее значимая трансформация происходит в передней трети стромы, что, по мнению ряда авторов, обуславливает эффект придания жесткости роговой оболочке. Экспериментальная оценка взаимосвязи механических свойств и изменение ультраструктуры роговиц свиней после CXL, проведенная Chang S. с соавторами [11], выявила увеличение на 28 % тангенциального модуля упругости материала, определяемого с помощью испытаний на одноосное растяжение. Отмечали преобразование структуры коллагена в пределах первых 300 мкм глубины роговицы: уменьшилось количество фибрилл на единицу площади на 8–12 %, увеличилась их толщина примерно на 5 % при улучшении микроциркуляции в межфибриллярном пространстве.

Инфракрасная (ИК) спектроскопия с преобразованием Фурье (Fourier-transform infrared spectroscopy, FTIR) ‒ методика, используемая для получения инфракрасного спектра поглощения или излучения, в частности, твердого тела, подтвердила образование межфибриллярных связей в результате воздействия CXL. Полученные данные показали, что жесткость тканей после применения рибофлавин-ультрафиолетового воздействия обусловлена такими параметрами, как диаметр коллагеновых фибрилл и их структурная плотность [11].

Применение ИК-спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения с Фурье-преобразованием (FTIR-ATR) позволило провести углубленное изучение механизмов формирования коллагеновых связей в роговице, в частности после CXL. Анализ спектров ATR-FTIR выявил влияние УФ излучения на коллагеновый матрикс свиных роговиц. Значительные изменения наблюдались в полосах, связанных с коллагеновыми сшивками. Кроме того, в результате вызванных воздействием УФ излучения биохимических изменений на молекулярном уровне выявлена существенная разница в оптическом рассеянии, происходящем в строме роговицы. Было показано, что повышенная дегидратация ткани роговицы практически не влияет на нативную структуру тройной спирали коллагена [12].

Анализ, проведенный с помощью поверхностной спектроскопии комбинационного рассеяния света (Surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS), показал, что общая вторичная структура коллагена не изменяется, в то время как модификации боковых цепей аминокислот являются наиболее характерным результатом сшивания. Было обнаружено образование вторичных и ароматических аминных групп, а также метиленовых и карбонильных групп [5]. В совокупности эти результаты свидетельствуют о значимых изменениях в ультраструктуре роговицы после CXL, включая создание новых сшивок в макромолекулах коллагена [12]. При этом CXL стабилизирует преимущественно меж- и внутрифибриллярное, но не межламеллярное сцепление [13].

По мере появления новых клинических протоколов CXL, основанных на снижении длительности процедуры с пропорциональным увеличением мощности ультрафиолета, потребовались сравнительные исследования эффективности различных режимов воздействия на роговицу. Было показано, что сокращение продолжительности УФ облучения, особенно менее 5 минут, не оказывает такого же биомеханического эффекта [14].

В экспериментальных исследованиях на роговицах крыс выявлено разрыхление пучков волокон коллагена, обусловленных развитием отека стромы в ранний (3–7 сут.) период наблюдений, сохраняющегося до 30 сут. эксперимента после стандартного УФ кросслинкинга («Дрезденский» протокол) с раствором рибофлавина. Аналогичные, но менее выраженные изменения наблюдали при проведении CXL с раствором рибофлавина, содержащим декстран с молекулярной массой 500 kDa («Декстралинк»), что связано с обезвоживающим и противоотечным эффектом полимера. При этом в обеих группах происходило снижение плотности кератоцитов в передних и средних слоях стромы роговицы [15].

Экспериментальные исследования in vivo на роговицах разных животных (куры и кролики) показали, что эффект CXL зависит от исходного состояния роговичного коллагена. УФ воздействие в присутствии рибофлавина практически не влияет на общую структуру роговицы, представляющей собой хорошо организованный коллагеновый комплекс, как, например, у кур или других птиц. Напротив, в роговицах кроликов первоначальное распределение коллагеновых волокон может быть частично организовано или не организовано. В этом случае CXL вызывает существенные позитивные изменения в строении коллагена. Типичным примером роговицы с неорганизованным расположением коллагена является роговица пациентов с кератоконусом, что свидетельствует о необходимости дальнейших разносторонних исследований влияния CXL на структуру слоев интактной и патологически измененной роговицы [16].

Изучение морфологических изменений в коллагеновых фибриллах парных роговиц свиней и кроликов, одна из которых была контрольной, а другая подверглась CXL, методами световой микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии, показало следующее. Установлено существенное снижение толщины центральной зоны роговицы животных, при этом коллагеновые фибриллы были более компактно и упорядоченно расположены в передней строме и менее плотно ‒ в задней. Их диаметр увеличился в передней и средней строме, что превосходило показатели измерений фибрилл более глубоких слоев. Отмечали статистически достоверное уменьшение межфибриллярного расстояния в различных областях роговицы кролика, тогда как изменений в задней части стромы роговицы свиней не наблюдалось [17].

Аналогичные изменения были отмечены и в экспериментальных исследованиях на крысах. Проведенные электронномикроскопические исследования средних слоев стромы роговицы крыс показали, что CXL способствовал увеличению фибриллярного диаметра и снижению плотности интраламеллярной упаковки фибрилл, наиболее выраженно наблюдаемой в раннем послеоперационном периоде (3 суток). Уменьшение плотности фибриллярной упаковки может быть следствием отека стромы, который на ультраструктурном уровне может сохраняться в течение нескольких месяцев. Выявленное увеличение диаметра фибрилл после CXL, очевидно, является одним из факторов повышения прочностных свойств роговой оболочки [18].

S. Akhtar с коллегами изучали ультраструктурные изменения центральной зоны и периферии роговицы крыс через 7 дней после применения стандартного протокола CXL с деэпителизацией (3 мВт/см²в течение 30 мин) [19]. Как показало исследование, после проведенного CXL в пределах одной и той же роговицы диаметр коллагеновых фибрилл и межфибриллярное расстояние в центре были значительно меньше по сравнению с таковыми на периферии [20]. В свою очередь, расстояние между фибриллами на периферии роговицы после CXL было существенно больше, чем в интактном контроле. Кроме того, площадь и плотность протеогликанов на периферии роговицы после CXL были значительно выше, чем в центральной части, что позволило авторам сделать предположение о большей эффективности CXL на периферии роговицы. Это может быть связано с более высоким содержанием люмикана, богатого лейцином, и более высокой диффузией кислорода и рибофлавина по периферии роговицы [21].

Изучение срезов роговицы кроликов с помощью SHG-визуализации (Second Harmonic Generation) показало, что коллагеновые волокна передней стромы после CXL (1–3 месяца) становятся значительно более выпрямленными по сравнению с ее задними слоями. В то время как волокна коллагена при меньшем влиянии CXL или без воздействия CXL выглядели гораздо более волнистыми [22, 23, 24]. Такой CXL-индуцированный эффект был назван авторами как «обжатие» коллагена. Возможно, это одна из причин уплотнения стромы в послеоперационном периоде (6 месяцев и более).

Другое исследование было посвящено гистологической оценке изменений в роговице кроликов после применения метода ускоренного сшивания коллагена – акселерированного CXL. Выявлено значительно большее (в 3 и более раз) количество апоптозных клеток в эндотелии и среди кератоцитов после CXL по сравнению с контрольной группой [25]. В ряде других экспериментальных исследований также отмечается апоптоз кератоцитов в передней и средней строме с незначительным повреждением эндотелиальных клеток [26]. Были представлены экспериментальные данные о том, что структура роговицы, измененная после CXL, ограничивает межламеллярную миграцию клеток и может приводить к нарушению нормального паттерна кератоцитов [27]. Таким образом, хотя CXL является надежным методом предотвращения прогрессирования КК, все еще существует риск повреждения эндотелиоцитов и связанных с ним осложнений, что свидетельствует о необходимости дальнейшего изучения данного вопроса.

Общепризнанная морфологическая картина стромы роговицы у пациентов с КК в ранний срок (1–30 суток) после CXL характеризуется, как правило, очаговым разволокнением коллагеновых пучков, вызванным развитием интра- и послеоперационного отека [8]. Кроме того, одним из неизменных последствий УФ воздействия на роговицу является гибель кератоцитов передней стромы. Имеются сведения, что в зоне лимба после CXL может наблюдаться снижение способности эпителиальных клеток к делению [28].

Проведенный in vitro иммуноанализ роговиц человека с КК показал, что CXL снижает жизнеспособность клеток, запускает апоптоз и ингибирует пролиферацию, не влияя на миофибробластическую трансформацию кератоцитов [29]. Как показывают результаты клинических исследований, после первоначального истощения кератоцитов в передней строме роговицы после CXL плотность клеток возвращается к среднему уровню через 6–12 месяцев после операции, что подтверждается исследованием с помощью конфокальной микроскопии [14]. Однако в ряде случаев может отмечаться стойкая потеря кератоцитов, что клинически может проявляться в виде визуально заметного роговичного рубца [30]. Одним из функциональных предназначений кератоцитов (особых фибробластов) является синтез основных типов коллагена и компонентов межклеточного матрикса. Соответственно, послеоперационное восстановление плотности кератоцитов является важным критерием долгосрочности CXL-индуцированного эффекта повышения биомеханической резистентности роговицы [31].

По данным Mazzotta C. с соавт., восстановление популяции кератоцитов у пациентов с КК начинается примерно через 1 мес. после CXL, усиливается на 3-м месяце и завершается примерно через полгода [32].

Клинические исследования показали, что CXL приводит к эпителиопатии в виде полиморфизма и полимегатизма эпителиальных клеток, снижению плотности и апоптозу кератоцитов, выраженному нарушению хода и структуры нервных волокон. Авторами было установлено, что процесс восстановления популяции кератоцитов происходит в сроки от трех до шести месяцев, нервных волокон – до года [33, 34]. Согласно данным других авторов, снижение чувствительности роговицы, связанное с утратой нервных волокон, отмечается на 15-е сутки после CXL, процесс начала их регенерации – через месяц и восстановление – через 6 месяцев [35]. Jordan C. с коллегами выявили тотальную потерю суббазального нервного сплетения и гибель кератоцитов передней стромы у пациентов с КК в раннем послеоперационном периоде с последующим (12 мес.) полным восстановлением поврежденных морфологических структур [36].

Следует отметить, что CXL помимо непосредственного лечебного эффекта несет и сопутствующее патогенетическое воздействие. Выраженность CXL-индуцированных осложнений в тканях глаза зависит от выбранного клинического протокола CXL, с соответствующим режимом УФ облучения и способом доставки фотосенсибилизатора в строму, исходного патологического состояния роговицы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ультрафиолетовый кросслинкинг роговичного коллагена с рибофлавином индуцирует в роговице в раннем (до 1 месяца) послеоперационном периоде характерные морфологические и ультраструктурные изменения, связанные с очаговым разволокнением коллагена стромы, изменением межфибриллярного расстояния, увеличением диаметра фибрилл, утратой поверхностных нервных волокон, активацией апоптоза кератоцитов со снижением их количества, при сохранности клеток эндотелия.

Морфологические кросслинкинг-ассоциированные изменения носят транзиторный характер (до 6 месяцев) и преимущественно затрагивают переднюю и среднюю строму роговицы. В последующем (от 6 до 12 месяцев) отмечается восстановление корнеальных нервных волокон, репопуляция кератоцитов, упорядочивание нарушенной межфибриллярной последовательности, уплотнение коллагеновой структуры с сохранением жесткости роговицы, в том числе за счет увеличения диаметра фибрилл коллагена.

Эффективность ультрафиолетового кросслинкинга зависит от исходного состояния роговичного коллагена. Положительные кросслинкинг-индуцированные эффекты более выражены на фоне патологически измененной роговицы, в частности, при кератоконусе, по сравнению с экспериментальными моделями УФ кросслинкинга, воспроизведенными на интактных лабораторных животных.