Development and validation of a method for screening NLRP3 inflammasome inhibitors on primary macrophages from C57bl/6j mice

Full Text

Инфламмасомы можно определить как высокомолекулярные белковые олигомеры, образующиеся в ответ на различные паттерны, и, являющиеся важными сигнальными молекулами врожденного иммунного ответа [1]. В настоящее время NLRP3 является наиболее распространенной и изученной инфламмасомой из-за ее набора активаторов и аберрантной активации в ряде воспалительных заболеваний [2]. Канонический путь активации инфламмасомы NLRP3 является каспаза-1-зависимым, в результате которого увеличивается уровень транскрипции неактивных предшественников про-ИЛ-1β, про-ИЛ-18 и прокаспазы-11. Вторичный воспалительный сигнал запускает формирование инфламмасомы. Неканонический путь активации инфламмасомы NLRP3 запускается внутриклеточным бактериальным липополисахаридом (ЛПС) и активирует другие каспазы, такие как каспаза-11.

В отличие от других сенсорных белков, NLRP3 может распознавать множество различных факторов, обусловленных не только патогеном, но и окружающей средой или хозяином, поэтому умеренная активация инфламмасомы NLRP3 повышает защиту организма от бактерий, вирусов и паразитов, а аномальная активация инфламмасомы NLRP3 считается инициатором при различных заболеваниях человека, таких как метаболический синдром, сахарный диабет 2-го типа, подагра, атеросклероз и нейродегенеративные заболевания [1, 3].

В частности, длительная активация инфламмасомы NLRP3 в макрофагах, инфильтрирующих жировую ткань, приводит к метаболическому воспалению, которое еще больше усиливает воспалительную среду в чувствительных к инсулину тканях [4].

Также было обнаружено, что инфламмасома NLRP3 играет важную роль в различных физиологических патологических процессах, в том числе, связана с некоторыми возрастными заболеваниями: развитием резистентности к инсулину, болезни Альцгеймера, Паркинсона, старением сердечно-сосудистой системы, потерей слуха и зрения [5].

Известны молекулы, которые действуют как ингибиторы воспаления NLRP3, что достигается путем ингибирования АТФ-чувствительных калиевых каналов (Глибурид), ингибирования активации каспазы-1 (Партенолид), ингибирования активности АТФазы NLRP3 (Партенолид, Bay 11-7082, производное акриламида), ингибирования высвобождения ИЛ-1β (MCC950) и ингибирования АТФ-рецептора P2X7 (AZD9056) [6].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Оптимизация метода определения активности NLRP3 в целях поиска новых ингибиторов активации инфламмасомы.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и оборудование. Используются мыши-доноры линии C57BL/6J, без специфических патогенов, в возрасте 3–6 мес. Содержание животных должно осуществляться в оборудованных вивариях и отвечать Международным рекомендациям Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях и правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ. Активность NLRP3 определяется по образованию ИЛ-1β с помощью коммерческих ИФА-наборов (Cloud-Clone, Китай) и изменению площади стимулированных ЛПС + АТФ мышиных макрофагов. Реактивы, используемые в эксперименте, предпочтительно приобретать у проверенных поставщиков – Sigma Aldrich (США), Диа-М (Россия), ПанЭко (Россия) и других.

Выделение перитонеальных макрофагов. Животным в асептических условиях с помощью стерильного одноразового шприца на 5 мл вводят внутрибрюшинно по 2 мл 3%-го раствора ферментативного пептона. Следует избегать попадания иглы в мочевой пузырь, кишечник и печень. Мышей экспонируют в течение 3 суток и подвергают эвтаназии методом цервикальной дислокации с последующей фиксацией на препаровальном столе. Важно делать эвтаназию быстро и аккуратно во избежание попадания крови в брюшную полость. Одновременно возможно умерщвление 2–5 мышей в зависимости от опыта специалиста. Место разреза обрабатывают 70%-м спиртом и послойно стерильными ножницами вскрывают брюшину «конвертом», обнажая стенку брюшной полости (рис. 1). Заполняют брюшную полость 10 мл охлажденным до +4–6 °С раствором Хенкса (без ионов Ca²⁺ и Mg²⁺, без фенолового красного) в объеме 5 мл с помощью стерильного одноразового шприца. Используя одноканальный дозатор со стерильным наконечником, лаваж аспирируют и переносят в стерильные пробирки объемом 15 мл, которые держат на льду в целях предотвращения адгезии клеток перитонеального экссудата к пластиковой стенке (рис. 1). Пробирки заполняются до метки. После каждой мыши инструменты и препаровальный стол тщательно обрабатывают 70%-м спиртом.

 

Рис. 1. Схема сбора перитонеального экссудата

 

Лаваж центрифугируют при 250 г в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок ресуспендируют охлажденным раствором Хенкса. Суспензию центрифугируют при 250 г в течение 5 мин, надосадочная жидкость снова отбрасывается, осадок тщательно ресуспендируют охлажденной полной питательной средой до объема 1 мл, представляющей собой раствор питательной среды DMEM с 2 мМ глутамина и содержанием глюкозы 4,5 г/л, дополненный 10%-й инактивированной телячьей эмбриональной сывороткой и смесью пенициллина и стрептомицина в концентрации 50 ЕД/мл. Из пробирок отбирают 10 мкл первичной клеточной суспензии и проводят окраску с 10 мкл 0,4%-го трипанового синего в стерильных эппендорфах. Проводят подсчет клеток на камере Горяева. Разводят суспензию охлажденной полной питательной средой до концентрации 1,5–2 × 10⁶ клеток/мл. Полученную клеточную суспензию вносят по 100 мкл в лунку культурального планшета (активные лунки). Краевые лунки заполняются только 250 мкл дистиллированной воды (рис. 2).

Инкубируют в течение 2 ч в СО₂-инкубаторе (уровень СО₂ 5 %, температура 37 °С). Затем промывают лунки планшета от погибших и не прикрепившихся макрофагов и других клеточных субпопуляций с помощью раствора Хенкса или DMEM (37 °С). После промывки доводят полной питательной средой до объема 180 мкл/лунка и инкубируют в течение 18 ч.

 

Рис. 2. Схема 96-луночного культурального планшета. Белым цветом обозначены краевые лунки, зеленым – интактные, желтым – ЛПС-контроль, оранжевым – ЛПС+АТФ-контроль, фиолетовым – лунки препарата сравнения, синие – опытные

 

Исследование активности инфламмасомы NLRP3. Вносят ЛПС (E. coli O127:B8, Sigma, США) в лунки планшета (за исключением интактных) в конечной концентрации 10 мкг/мл (рис. 2). Инкубируют в течение 24 ч и вносят исследуемые вещества. Конечная концентрация составляет 100 мкМ (скрининговая концентрация) или используется диапазон концентраций 0,1–100 мкМ для определения зависимости «концентрация-активность». Обработка клеток веществами длится 1 ч в инкубаторе, после чего в лунки (за исключением ЛПС-контроля и интактных) вносят раствор АТФ с конечной концентрацией 5 мМ (рис. 2). После 1,5-часовой инкубации с раствором АТФ делается забор супернатанта для определения ИЛ-1β с помощью ИФА-наборов (Cloud-Clone, Китай). Супернатант допустимо заморозить, если не планируется использовать его сразу. Также целесообразно определение цитотоксичности соединений методом ЛДГ-теста [7]. После забора супернатанта клетки проводят окраску макрофагов по Май-Грюнвальду с целью измерения клеточной площади и оценки морфологических изменений.

Обработка результатов. Измерения и расчет IC₅₀ исследуемых веществ и препарата сравнения проводятся в трех независимых экспериментах. Данные обрабатываются с использованием MS Excel и GraphPad Prism 8.4.3. Величины IC₅₀ вычисляют с помощью нелинейной 3-параметрической регрессии. Статистическая значимость определяется с применением непараметрического критерия Краскела – Уоллиса с пост-тестом Данна.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Определили влияние различных факторов на продукцию ИЛ-1β, таких как продолжительность стимуляции макрофагов (время инкубации) и конечная концентрация ЛПС и АТФ в питательной среде. Показано, что наиболее оптимальной является 24-часовая обработка клеток 10 мкг/мл ЛПС. При этом последующая активация инфламмасом раствором АТФ в конечной концентрации 5 мМ существенно увеличивает продукцию интерлейкина. Напротив, при концентрации 1 мМ АТФ в питательной среде эффект менее выражен, а использование более концентрированных растворов (10 мМ) не дает значимого прироста продукции ИЛ-1β, что, по-видимому, свидетельствует о достижении клетками «метаболического максимума» (рис. 3).

 

Рис. 3. Секреция ИЛ-1β через 3,5 ч и 24 ч после стимуляции ЛПС перитонеальных макрофагов

 

Было оценено влияние глибенкламида на синтез ИЛ-1β в диапазоне концентраций 0,001–50 мкМ (рис. 4). Также оценивали изменение площади макрофагов, обработанных данным препаратом в диапазоне концентраций 0,1–100 мкМ (рис. 5).

Рис. 4. Зависимость «концентрация-активность» глибенкламида на секрецию ИЛ-1β
* p < 0,05; ** p <0,005; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

 

Рис. 5. Снижение площади стимулированных ЛПС + АТФ макрофагов под действием глибенкламида в диапазоне концентраций 0,1–100 мкМ (n = 100). Статистическая значимость по сравнению с контролем LPS + ATP. Тест Краскела – Уоллиса с посттестом Данна

 

Для оценки качества методики рассчитали Z-фактор по формуле:

$Z = 1-$ $\frac{3·\left({\sigma }_{\rho } + {\sigma }_n\right)}{\left|{\mu }_{\rho } - {\mu }_n\right|}$

где ${\sigma }_{\rho }$ и ${\sigma }_n$ – стандартные отклонения положительного (ЛПС + АТФ) и отрицательного (интакт) контроля; ${\mu }_{\rho }$и ${\mu }_n$ – средние значения положительного и отрицательного контроля соответственно. $Z < 0$ является неприемлемым; $0 \le Z < 0,5$ означает среднее качество; $0,5 \le Z < 1$ – отличное качество; $Z = 1$ – идеальный показатель [8]. В использованных нами условиях значение $Z$ - фактора составило 0,81.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате исследования были подобраны оптимальные концентрации ЛПС и АТФ, а также время инкубации перитонеальных макрофагов мышей. Оценкой оптимальных условий проведения исследования послужило значение Z-фактора. На основании выбранных условий была оценена ингибиторная активность глибенкламида в отношении активации NLRP3 стимулированных ЛПС + АТФ мышиных макрофагов по показателям синтеза ИЛ-1β и клеточных площадей.

About the authors

Roman D. Danilov

Volgograd State Medical University

Author for correspondence.
Email: romkan43@gmail.com

postgraduate student of the Department of Pharmacology and Bioinformatics, laboratory assistant researcher at the Laboratory of Metabotropic Medicines, Scientific Center for Innovative Medicines with Pilot Production

Russian Federation, Volgograd

Elena V. Sokolova

Volgograd State Medical University

Email: sokolova210795@gmail.com

Postgraduate student of the Department of Pharmacology and Bioinformatics, Scientific Center for Innovative Medicines with Pilot Production

Russian Federation, Volgograd

Ekaterina K. Zakharova

Volgograd State Medical University

Email: ekzakharova1@gmail.com

Candidate of Chemical Sciences, Associate Professor, Associate Professor of the Department of Chemistry, Laboratory Assistant Researcher at the Laboratory of Metabotropic Medicines, Scientific Center for Innovative Medicines with Pilot Production

Russian Federation, Volgograd

Denis A. Babkov

Volgograd State Medical University

Email: denis.a.babkov@gmail.com

Doctor of Pharmaceutical Sciences, Professor, Professor of the Department of Pharmacology and Bioinformatics, Director of the Scientific Center for Innovative Medicines with Pilot Production, Senior Researcher at the Laboratory of Metabotropic Medicines, Scientific Center for Innovative Medicines with Pilot Production

Russian Federation, Volgograd

References

Supplementary files