Influence of Dalargin on the hematological indices in mice with experimental ulcerative colitis

Full Text

Язвенный колит (ЯК) – хроническое, рецидивирующее заболевание толстого кишечника, впервые развивающееся преимущественно у молодых людей в возрасте 20–40 лет, приводящее к тяжелым осложнениям и инвалидизации пациентов [1]. Патогенез язвенного колита включает следующие этапы: нарушение барьерной функции слизистой оболочки толстого кишечника, пенетрация комменсальной и патогенной микрофлоры в глубокие слои кишечной стенки, патологическая активация нейтрофилов, макрофагов, дендритных клеток, лимфоцитов с последующим развитием иммунного воспаления [1]. Низкая эффективность существующих методов терапии ЯК обусловливает необходимость внедрения новых способов его лечения. Ранее показана важная роль генетических факторов в развитии ЯК, что открывает перспективы использования генной терапии [1]. Установлена важная роль оксидативного стресса в повреждении кишечной стенки при патологии толстого кишечника [2]. Учитывая вышесказанное, использование препаратов, обладающих широким спектром фармакологической активности, включая иммуномодулирующее и антиоксидантное действие, представляет несомненный интерес.

Даларгин эффективен при лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта, проявляет иммуномодулирующее и антиоксидантное действие [3]. Ранее установлено его корригирующее действие при экспериментальном ЯК у мышей, что проявлялось уменьшением индекса активности болезни, распространенности язв и инфильтратов в стенке толстого кишечника [4]. При этом механизм фармакологического влияния даларгина при ЯК требует дальнейшего изучения.

Известно, что гематологические индексы используются как удобные и информативные маркеры, позволяющие судить о тяжести воспаления, активности врожденного и адаптивного клеточного иммунитета при различных патологических процессах [5, 6].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучение влияние даларгина на динамику гематологических индексов у мышей с экспериментальным язвенным колитом.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены на 104 мышах-самцах Balb/C весом 21–23 г. Животные были разделены на следующие группы: 1) интактная – 8 мышей; 2) ЯК + физраствор подкожно – 24 мыши; 3) ЯК + физраствор внутрижелудочно – 24 мыши; 4) ЯК + даларгин – 24 мыши; 5) ЯК + сульфасалазин – 24 мыши. Язвенный колит моделировали заменой питьевой воды 5%-м раствором декстрана сульфата натрия (ДСН) (Mr = 40000, «neoFroxx GmbH», ФРГ) в кипяченой воде на 5 суток [7]. Животных выводили из эксперимента на 5, 7 и 28-е сутки. У мышей забирали периферическую кровь в объеме 0,5 мл. Рассчитывали лейкоцитарную формулу в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе, и вычисляли следующие индексы: 1) индекс Кребса (отношение нейтрофилов к лимфоцитам); 2) коэффициент Бредекка (отношение лимфоцитов к палочкоядерным нейтрофилам); 3) лейкоцитарный индекс (ЛИ) (отношение лимфоцитов к нейтрофилам); 4) индекс соотношения нейтрофилов и моноцитов (ИСНМ); 5) индекс соотношения лимфоцитов и моноцитов (ИСЛМ); 6) индекс соотношения лимфоцитов и эозинофилов (ИСЛЭ) [6].

Даларгин (Тир-D-Ала-Гли-Фен-Лей-Арг) (НПО «Микроген», РФ) применяли подкожно в объеме 0,1 мл в физрастворе в дозе 100 мкг/кг 1 раз в сут. 7 дней с начала моделирования ЯК. Сульфасалазин («КРКА», Словения) вводили мышам внутрижелудочно в виде суспензии в физрастворе в дозе 200 мг/кг в объеме 0,3 мл семикратно с начала моделирования ЯК. Физраствор вводили подкожно (0,1 мл) или внутрижелудочно (0,3 мл) 1 раз в сут. 7 дней. Эксперименты проведены с соблюдением принципов гуманного отношения к лабораторным животным [8], Правил надлежащей лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ № 199н от 01.04.2016 г.) и одобрены Региональным этическим комитетом КГМУ (протокол заседания секции доклинических исследований РЭК № 1 от 03.04.2023).

Непараметрический U-критерий Манна – Уитни использовали для проверки статистических гипотез при p ≤ 0,05. Материал представлен как медиана (Me), нижний (Ql) и верхний (Q3) квартили. Статобработка выполнена с помощью программного обеспечения Statistica версия 13.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Моделирование ЯК мышам Balb/C сопровождалось увеличением индекса Кребса на 7,3–10,9 % (P = 0,0033–0,0101), снижением ЛИ на 28,3–30,0 % (P = 0,0009) и ИСЛМ на 33,4–35,1 % (P = 0,0023–0,0054) на 5-е сут. эксперимента (табл. 1, 2). На 7-е сут. эксперимента только ЛИ значимо ниже в контрольных группах, чем у интактных мышей: на 21,1–22,4 % (P = 0,0009). На 28-е сут. у мышей с хроническим ЯК все изучаемые индексы значимо отличались от аналогичных значений у интактных крыс. Показано снижение индекса Кребса на 45,5 % (P = 0,0009), ИСНМ на 46,2–49,2 % (P = 0,0009), ИСЛМ на 30,2–30,8 % (P = 0,0039). Остальные индексы, напротив, увеличивались: ЛИ на 40,1–40,9 % (P = 0,0009), индекс Бредекка в 3,87–3,92 раза (P = 0,0009), ИСЛЭ в 2,41–2,43 раза (P = 0,0009). Применение даларгина мышам с экспериментальным ЯК приводило к уменьшению индекса Кребса на 16,9 % (P = 0,0009), увеличению ЛИ на 21,8 % (P = 0,0009), ИСНМ на 34,5 % (P = 0,0054), ИСЛМ на 65,0 % (P = 0,0009) на 5-е сутки эксперимента. На 7-е сутки только ИСЛЭ значимо выше у мышей группы ЯК + даларгин по сравнению с контрольной на 96,7 % (P = 0,0357).

У мышей с хроническим ЯК (28-е сут.) отсутствовали значимые различия между сравниваемыми группами (P > 0,05). Введение сульфасалазина сопровождалось снижением индекса Кребса на 14,8 % (P = 0,0028) и увеличением ИСЛМ на 53,7 % (P = 0,0117) по сравнению со второй контрольной группой. Только один показатель значимо изменялся у мышей с ЯК + сульфасалазин: ЛИ был ниже на 7,5 % (P = 0,0157) на 28-е сут. При сравнении эффектов препаратов установлено, что индекс Кребса выше в группе ЯК + сульфасалазин на 6,1 % (P = 0,0274), ЛИ меньше на 6,3 % (P = 0,0274), ИСЛМ ниже на 4,5 % (P = 0,0357) на 5-е сут. эксперимента. На 7-е сут. ИСЛЭ ниже у мышей с ЯК, получавших даларгин, на 5,0 % (P = 0,0117). На 28-е сут. эксперимента индекс Кребса у мышей группы ЯК + даларгин ниже на 6,7 % (P = 0,0136), ЛИ выше на 8,1 % (P = 0,0087), ИСЛМ больше на 15,7 % (P = 0,0039), а ИСЛЭ на 3,8 % (P = 0,0039).

 

Таблица 1

Влияние даларгина на индекс Кребса, индекс Бредекка, индекс соотношения нейтрофилов и моноцитов у мышей с язвенным колитом (Me [Q1; Q3])

Группа	Срок экспери мента, сут.	Индекс Кребса (отношение нейтрофилов к лимфоцитам)	Индекс Бредекка (отношение лимфоцитов к палочкоядерным нейтрофилам)	Индекс соотношения нейтрофилов и моноцитов
Интактная (n = 8)		0,55 [0, 54; 0, 56]	14,1 [12, 4; 18, 3]	13,0 [12, 3; 20, 3]
Контрольная группа № 1 (язвенный колит + физраствор) (n = 24)	5	0,59 [0, 58; 0, 62] xP = 0,0033	14,9 [12, 3; 17, 4] P = 0,7527	11,9 [11, 5; 12, 3] P = 0,1563
	7	0,55 [0, 54; 0, 56] P = 1,0000	14,1 [12, 4; 18, 3] P = 1,0000	15,5 [14, 0; 22, 5] P = 0,2271
	28	0,30 [0, 29; 0, 32] xP = 0,0009	55,3 [36, 3; 74, 5] xP = 0,0009	7,0 [5, 8; 7, 3] xP = 0,0009
Контрольная группа № 2 (язвенный колит + физраствор) (n = 24)	5	0,61 [0, 59; 0, 62] xP = 0,0101	15,7 [14, 1; 20, 9] xP = 0,0009	14,8 [14, 0; 23, 8] P = 0,4309
	7	0,54 [0, 53; 0, 56] P = 0,3720	14,9 [12, 4; 15, 2] P = 0,2076	12,0 [10, 0; 18, 3] P = 0,1278
	28	0,30 [0, 30; 0, 31] xP = 0,0009	54,5 [36, 8; 72, 5] xP = 0,0009	6,6 [5, 5; 7, 3] xP = 0,0009
Группа язвенный колит + даларгин в дозе 100 мкг/кг (n = 24)	5	0,49 [0, 46; 0, 50] *P = 0,0009 1P = 0,0274	16,2 [14, 4; 19, 3] P = 0,1563, 1P = 0,5635	16,0 [15, 3; 31, 5] *P = 0,0054 1P = 0,8336
	7	0,54 [0, 53; 0, 58] P = 0,9164. 1P = 0,8136	15,4 [15, 1; 19, 9] P = 0,6365, P = 0,1152	11,0 [8, 0; 17, 0] P = 0,5286, P = 0,1152
	28	0,30 [0, 29; 0, 31] P = 0,9164 1P = 0,0136	37,5 [36, 8; 74, 0] P = 0,7929, P = 0,0831	7,5 [7, 3; 9, 4] P = 0,0742, P = 0,3720
Группа язвенный колит + сульфасалазин 200 мг/кг (n = 24)	5	0,52 [0, 51; 0, 52] *P = 0,0028	15,9 [14, 1; 20, 7] P = 0,0660	16,0 [14, 1; 20, 7] P = 1,0000
	7	0,54 [0, 54; 0, 54] P = 0,9164	18,3 [15, 7; 21, 0] P = 0,4008	14,2 [11, 2; 17, 0] P = 0,7132
	28	0,32 [0, 32; 0, 32] P = 1,0000	36,0 [36, 0; 72, 5] P = 0,1563	6,9 [5, 7; 7, 7] P = 0,4008

Примечание: здесь и далее: ^х p < 0,05 по сравнению с интактной группой; * p < 0,05 по сравнению с контрольной группой; ¹ p < 0,05 по сравнению с группой ЯК + сульфасалазин.

 

Таблица 2

Влияние даларгина на индекс лимфоцитов и моноцитов, индекс лимфоцитов и эозинофилов, лейкоцитарный индекс у мышей с язвенным колитом (Me [Q1; Q3])

Показатели	Срок экспери мента,  сут.	Индекс  соотношения  лимфоцитов и  моноцитов	Индекс соотношения лимфоцитов и эозинофилов	Лейкоцитарный индекс (отношение лимфоцитов к нейтрофилам)
1	2	3	4	5
Интактная		30,8 [30, 5; 47, 0]	30,5 [20, 9; 46, 8]	2,37 [2, 30; 2, 53]
Контрольная группа № 1 (язвенный колит  + физраствор)	5	20,0 [19, 7; 20, 4] xP = 0,0023	59,5 [44, 5; 61, 0] P = 0,2936	1,70 [1, 63; 1, 75] xP = 0,0009
	7	31,0 [30, 5; 47, 5] P = 0,8336	30,5 [20, 3; 31, 5] P = 0,8336	1,84 [1, 78; 1, 85] xP = 0,0009
	28	21,5 [18, 2; 24, 9] xP = 0,0039	73,5 [72, 5; 74, 5] xP = 0,0009	3,34 [3, 15; 3, 47] xP = 0,0009
Контрольная группа № 2  (язвенный колит  + физраствор)	5	20,5 [17, 5; 30, 0] xP = 0,0054	60,0 [59, 5; 61, 0] P = 0,1563	1,66 [1, 63; 1, 74] xP = 0,0009
	7	31,5 [31, 0; 47, 5] P = 0,4623	47,3 [31, 0; 63, 0] P = 0,1563	1,87 [1, 81; 1, 90] xP = 0,0009
	28	21,3 [18, 3; 24, 3] xP = 0,0039	73,0 [72, 0; 74, 0] xP = 0,0009	3,32 [3, 23; 3, 36] xP = 0,0009
Группа язвенный колит + даларгин в дозе  100 мкг/кг	5	33,0 [32, 3; 64, 0] *P = 0,0009	32,8 [31, 8; 33, 0] P = 0,2271	2,07 [2, 00; 2, 17] *P = 0,0009
	7	24,9 [17, 8; 29, 8] *P = 0,0063	60,0 [59, 0; 61, 0] *P = 0,0357	1,84 [1, 74; 1, 90] P = 0,8748
	28	24,9 [24, 7; 30, 8] P = 0,1036	74,0 [73, 5; 75, 0] P = 0,9977	3,34 [3, 22; 3, 41] P = 1,0000
Группа язвенный колит + сульфасалазин  200 мг/кг	5	31,5 [26, 0; 47, 0] *P = 0,0117, 1P = 0,0357	31,3 [31, 0; 31, 8] P = 0,0587, P = 0,0929	1,94 [1, 93; 1, 97] P = 0,0016, 1P = 0,0274
	7	26,2 [21, 0; 31, 5] P = 0,1415, P = 0,1036	63,0 [62, 0; 63, 0] P = 0,3720, 1P = 0,0117	1,85 [1, 85; 1, 87] P = 0,8748, P = 0,7929
	28	21,0 [18, 0; 24, 2] P = 0,3446, 1P = 0,0039	71,5 [36, 0; 72, 5] P = 0,0520, 1P = 0,0019	3,07 [3, 00; 3, 17] *P = 0,0157, 1P = 0,0087

 

Полученные в работе результаты подтверждают развитие острого ЯК на 5-е и 7-е сут. и хронического воспаления толстого кишечника на 28-й день. Общепризнано, что ЛИ отражает взаимоотношение гуморального и клеточного звеньев иммунной системы [6]. Снижение этого индекса при остром ЯК указывает на включение клеточных иммунных механизмов в процессе развития воспаления в толстом кишечнике.

Индекс соотношения лимфоцитов и моноцитов отражает взаимоотношение аффекторного и эффекторного звеньев иммунного ответа [6]. Статистически значимое увеличение ИСЛМ у мышей с ЯК, получавших даларгин, на 5-е сут. эксперимента подтверждает стимулирующее действие препарата на аффекторное звено иммунитета, а снижение этого индекса на 7-е сут. – на активацию эффекторного звена. Ранее показано, что ИСНМ характеризует микрофагальное и макрофагальное звенья системы врожденного иммунитета [6]. По-видимому, изменение гематологических индексов на 5-е и, главным образом, на 7-е сут., обусловлено корригирующим действием даларгина на активность клеток макрофагально-моноцитарного пула. Установлено, что при развитии ЯК увеличивается количество опиоидных μ-рецепторов на макрофагах в стенке ободочной кишки [9]. Даларгин – аналог лей-энкефалина, который связывается с опиоидными δи μ-рецепторами [3]. Фармакологическое действие даларгина при ЯК связано, по-видимому, с активацией опиоидных μ-рецепторов на иммунокомпетентных клетках.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные позволяют сделать вывод о связи противовоспалительного действия даларгина при экспериментальном ЯК с его модулирующим влиянием на макрофагальное звено врожденного иммунитета, а также аффекторное и эффекторное звенья клеточного иммунного ответа. При этом корригирующее влияние даларгина на гематологические индексы у мышей с ЯК выше, чем у препарата сравнения сульфасалазина, что подтверждается статистически значимыми различиями их действия на индекс Кребса, ЛИ, ИСЛМ, ИСЛЭ.

 

***

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

About the authors

Andrey Yu. Lyashev

Kursk State Medical University

Author for correspondence.
Email: andr.liashev@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7170-0416

attached to the Department of Pharmacology to prepare his dissertation

Russian Federation, Kursk

Galina S. Mal

Kursk State Medical University

Email: malgs@kursksmu.net
ORCID iD: 0000-0003-2723-781X

Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Department of Pharmacology

Russian Federation, Kursk

Maria A. Zatolokina

Kursk State Medical University; I.S. Turgenev Orel State University

Email: marika1212@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9553-1597

Doctor of Medical Sciences, Professor of the Department of Histology, Embryology, Cytology, Head of the Department of Histology, Cytology and Embryology

Russian Federation, Kursk; Orel

Kirill D. Spiridonov

Kursk State Medical University

Email: kirill.spiridonov.2012@bk.ru
ORCID iD: 0009-0004-0957-3398

6th year student of the Faculty of Medicine

Russian Federation, Kursk

Daniil D. Spiridonov

Kursk State Medical University

Email: d.spiridonov2112@gmail.com
ORCID iD: 0009-0005-9549-1387

6th year student of the Faculty of Medicine

Russian Federation, Kursk

Aleksei V. Tverskoi

Belgorod State National Research University

Email: tverskoy@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0003-1537-6564

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Head of the Department of Human Anatomy and Histology, Medical Institute

Russian Federation, Belgorod

References

Supplementary files