Dark cytotoxicity of new synthesized complexes based on Chlorin e6 with rare earth elements on Ehrlich ascitic adenocarcinoma cell culture
- 作者: Shevchenko O.V.1,2, Eliseeva E.V.1, Yurieva K.A.1, Belobeletskaya M.V.2, Medkov M.A.2
-
隶属关系:
- Pacific State Medical University
- Institute of Chemistry of the Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences
- 期: 卷 22, 编号 3 (2025)
- 页面: 143-149
- 栏目: Original Researches
- URL: https://journals.eco-vector.com/1994-9480/article/view/692514
- DOI: https://doi.org/10.19163/1994-9480-2025-22-3-143-149
- ID: 692514
如何引用文章
全文:
详细
Today, the issue of the safety and selectivity of new classes of compounds is acute. These compounds have properties that have not been described before. The purpose of this study is to present results of the investigation of the toxicity and accumulation of two newly synthesized compounds, e6-europium chloride and e6-samarium chloride, in relation to an Ehrlich ascetic adenocarcinoma cell culture. An assessment of these parameters is crucial for understanding the level of toxicity and potential side effects. It is known that substances used in clinical practice can initiate photoreactions in patients, so it is important to study their properties. Using the MTT test, we assessed the metabolic activity of cells after contact with the compounds for 2 days. The concentrations of e6-europium Chloride and e6-samarium chloride were 25 and 0.19 micrograms per milliliter, respectively. The number of viable cells after exposure was more than 80 %. Using flow cytometry, the maximum accumulation of substances in cells was determined after one day of co-incubation. Based on these indicators, we were able to determine the range of concentrations at which there was no direct cytotoxic effect on the cell culture. This data will serve as a basis for further assessment of the compounds' effectiveness and their mode of action.
全文:
Одним из необходимых оценочных параметров при разработке потенциальных фотосенсибилизаторов (ФС) является темновая цитотоксичность [1, 2, 3]. Известно, что механизм действия ФС основывается на способности им поглощать квант света с последующей генерацией активных форм кислорода, разрушающих клетки опухоли. Несмотря на это, необходимо оценивать безопасность именно соединения, без воздействия источником излучения, для выбора безопасных концентраций с целью проведения дальнейших работ [2, 3]. Более того, выбор диапазона вносимых концентраций веществ также должен основываться на селективности накопления субстанций в опухолевых клетках для уменьшения эффекта воздействия на непораженные участки [4].
В рамках настоящего исследования проведено изучение темновой токсичности впервые синтезированных порошков Хлорин е6-европий и Хлорин е6-самарий в отношении культуры клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха (АКЭ) методом спектрофотометрического калориметрического МТТ-теста. С применением метода проточной цитометрии проведена количественная оценка накопления Хлорина е6 (вещество сравнения), Хлорин е6-европий и Хлорин е6-самарий.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Оценить темновую токсичность впервые синтезированных комплексов на основе Хлорина е6, допированного редкоземельными элементами, на модели клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Синтез комплексных соединений. В работе использовали коммерческий препарат «Фотодитазин» (Хлорин е6, ООО «Вета-Гранд, Россия), хлорид европия EuCl3∙6Н2О (х.ч.), хлорид самария SmCl3∙6Н2О (х.ч.). Концентрации Хлорина Е6 и Eu(III) или Sm(III) в исходных растворах составляли 5 × 10-3 моль/л и 6,6 × 10-3 моль/л соответственно. Предварительно в каждом из исходных растворов создавали рН = 6,5–7,3 добавлением к раствору димеглюмина хлорина Е6 разбавленной 1:1 соляной кислоты HCl (х.ч.), а к раствору хлорида европия или хлорида самария 10%-го раствора аммиака NH4OH. К раствору, содержащему Хлорин е6, добавляли раствор европия или самария в мольном соотношении 1 : 1 при перемешивании на магнитной мешалке до образования осадка. Образующийся в виде осадка продукт взаимодействия (комплекс) хлорина Е6 с европием или самарием отфильтровывали и высушивали на воздухе.
Подготовка клеточной культуры. Культивирование клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха осуществляли согласно протоколу [5]. Все исследования проведены после одобрения Междисциплинарным комитетом по этике ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России (протокол № 8 от 08.04.2024).
Определение темновой токсичности и накопления. Для оценки темновой токсичности исследуемые вещества в концентрациях от 0,19 до 100 мкг/мл (при двукратном разбавлении) вносили к культуре клеток АКЭ (1 × 106 кл/мл) через 1 сут. после посадки в 96-луночный планшет с дальнейшим помещением в CO2-инкубатор и ограниченным воздействием прямых солнечных лучей. Количество жизнеспособных клеток отмечали через 2 сут. контакта с применением МТТ-теста согласно методике [6], регистрируя сигнал оптической плотности на спектрофотометре Allsheng FlexA-200 (Allsheng, КНР) при λ = 530. Референсные значения определяли при λ = 620 нм. При интерпретации результатов 100 % жизнеспособных клеток составляли оптические плотности, содержащие клетки отрицательного контроля (интактные), то есть без внесения исследуемых субстанций. Все измерения проводили в трехкратной повторности. В качестве вещества сравнения во всех исследованиях применяли широко применяемый фотосенсибилизатор порфиринового ряда Хлорин е6. Количественное изучение клеток, поглотивших изучаемые вещества, оценивали с применением метода проточной цитофлуориметрии (MacsQuant Analyzer 10, Militenyi Biotec, Германия) при трехкратном измерении по каналу R1 (λвозбуждения = 635 нм, λиспускания = 655–730 нм). Анализ данных осуществляли с помощью программного обеспечения Kaluza Analysis 2.8 (Beckman Coulter, США).
Статистический анализ данных. Полученные данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Статистический анализ выполнен с использованием ANOVA, реализованного в программном обеспечении Sigma Plot 11.0 (Systat Software Inc., США). Различия между группами считались значимыми, если соответствующее p-значение было меньше 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Согласно данным калориметрического МТТ-теста процент жизнеспособных клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха на 2-е сутки после внесения суспензии Хлорин е6-европий в концентрации 100 мкг/мл составил (77,82 ± 3,89) %. Для меньших концентраций количество метаболически-активных клеток более 80 %. Отмечено (95,22 ± 4,76) % живых интактных клеток и (11,86 ± 0,59) % клеток положительного контроля (после внесения 20 % диметилсульфоксида) (рис. 1).
Рис. 1. Жизнеспособность клеток АКЭ через 2 сут. контакта с Хлорин е6-европий по данным МТТ-теста
Аналогичные исследования темновой токсичности проведены для Хлорина е6, допированного самарием. Результаты демонстрируют высокую жизнеспособность для всего диапазона вносимых к культуре АКЭ концентраций: (97,80 ± 2,45) % для 100 мкг/мл (рис. 2).
Рис. 2. Жизнеспособность клеток АКЭ через 2 сут. контакта с Хлорин е6-самарий по данным МТТ-теста
Следует отметить, что исследовалась также токсичность Хлорина е6 как контрольного вещества в условиях отсутствия непосредственного воздействия лучей света. Выживаемость клеток более 80 % отмечена для 12,5 мкг/мл, (85,85 ± 4,29) %, и ниже, при прежних значениях контролей. Наиболее токсичными оказались концентрации: 100; 25 и 12,5 мкг/мл. После контакта со 100 мкг/мл количество мертвых клеток составило (84,05 ± 4,20) % (рис. 3).
Рис. 3. Жизнеспособность клеток АКЭ через 2 сут. контакта с Хлорин е6 по данным МТТ-теста. Ось абсцисс – краситель аллофикоцианин (аllophycocyanin, APC), канал В6; ось ординат – количество клеток в 100 мкл, абс. ед.
Для объяснения этих явлений изучали биодоступность (интенсивность накопления) впервые полученных веществ в клетках АКЭ.
Согласно данным проточной цитофлуориметрии количество флуоресцирующих клеток, то есть поглотивших вещества, через 1 сут. после контакта с концентрациями Che6-Eu от 100 до 25 мкг/мл составило от (99,21 ± 4,96) и (98,93 ± 4,95) % соответственно.
После контакта с 100 мкг/мл Che6-Sm (99,17 ± 4,96) %. Для свободной молекулы Хлорина е6: 100 мкг/мл (92,44 ± 4,62) % и для 25 мкг/мл (89,74 ± 4,49) %, при значениях отрицательного контроля (0,04 ± 0,002) % и (98,93 ± 1,98) % для положительного (рис. 4).
Рис. 4. Гистограммы интенсивности флуоресценции клеток аденокарциномы Эрлиха через 2 сут. контакта с: а) 25 мкг/мл Хлорин е6-европий; б) 25 мкг/мл Хлорин е6-самарий; в) интактными клетками (без внесения Chе6-Eu или Chе6-Sm); г) клетками положительного контроля (20 % ДМСО)
Результаты свидетельствуют о большей биодоступности Хлорин е6-европий в ряду впервые синтезированных веществ для клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха. Стоит отметить, что при максимальном накоплении вещества через 1 сут. контакта значения темновой токсичности остаются низкими, что обуславливает, на начальном этапе, безопасность применения веществ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В рамках настоящего исследование проведено изучение возможности накопления впервые синтезированных субстанций на основе фотосенсибилизатора порфиринового ряда Хлорина е6, допированного редкоземельными элементами европием или самарием. Полученные данные по накоплению в клетках АКЭ согласуются с результатами по темновой токсичности соединений. Стоит отметить высокую токсичность не допированного Хлорина е6, которая при 100 мкг/мл в (4,88 ± 0,24) раза превышает значения для Che6-Eu и в (6,13 ± 0,31) раза для Che6-Sm, что подтверждается многочисленными исследованиями [7, 8, 9, 10], в том числе на клетках глиомы и нормальных нервных клетках [8]. Таким образом, полученный нами материал представляет собой перспективную платформу в качестве фотосенсибилизатора нового поколения.
作者简介
Olga Shevchenko
Pacific State Medical University; Institute of Chemistry of the Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences
编辑信件的主要联系方式.
Email: shevchenko.ov@tgmu.ru
Candidate of Biological Sciences, Researcher at the Interdisciplinary Laboratory Center
俄罗斯联邦, Vladivostok; VladivostokEkaterina Eliseeva
Pacific State Medical University
Email: yeliseeff23@gmail.com
MD, Professor, Head of the Department of General and Clinical Pharmacology
俄罗斯联邦, VladivostokKsenia Yurieva
Pacific State Medical University
Email: yureva.ka@tgmu.ru
4-year student specializing in Medical Biochemistry
俄罗斯联邦, VladivostokMargarita Belobeletskaya
Institute of Chemistry of the Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences
Email: rita@ich.dvo.ru
Candidate of Chemical Sciences, Senior Researcher at the Laboratory of Mineral Processing
俄罗斯联邦, VladivostokMikhail Medkov
Institute of Chemistry of the Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences
Email: medkov@ich.dvo.ru
Doctor of Chemical Sciences, Professor, Head of the Laboratory of Mineral Processing
俄罗斯联邦, Vladivostok参考
- Yanitskaya A.V., Yarkovoy M.A., Malaeva E.V., Zemlyanskaya E.A., Strusovskaya N.L. Anatomo-morphological investigation of fruits Psoralea corylifolia L. (Fabaceae). Volgogradskii nauchno-meditsinskii zhurnal = Volgograd Scientific and Medical Journal. 2019;4:50–53. (In Russ.).
- Correia J.H., Rodrigues J.A., Pimenta S., Dong T., Yang Z. Photodynamic Therapy Review: Principles, Photosensitizers, Applications, and Future Directions. Pharmaceutics. 2021;13(9):1332. doi: 10.3390/pharmaceutics13091332.
- Li Y., Zhang P., Xie Y., Yang J., Yang Y., Shi L. et al. Photosensitizers with multiple degradation modes for efficient and postoperatively safe photodynamic therapy. Biomaterials. 2023;299:122182. doi: 10.1016/j.biomaterials.2023.122182.
- Baranov A.V., Kornev A.I., Boriskin A.A. Photosensitizer accumulation in the bladder mucosa in chronic cystitis. Lazernaya meditsina = Laser Medicine. 2021;24(2–3): 9–14. (In Russ.) doi: 10.37895/2071-8004-2020-24-2-3-9-14.
- Abdulrahman J.M., AbdElsamie G.H., Al-Rawi R.A., Abd El Kaream S.A. Anti-tumor synergistic activity of nano-chlorophyll with sonophotodynamic on Ehrlich ascites carcinoma in mice. Zanco Journal of Medical Sciences. 2020;24(1): 132–142. doi: 10.15218/zjms.2020.016.
- Otvagin V.F., Kuzmina N.S., Kudriashova E.S., Nyuchev A.V., Gavryushin A.E., Fedorov A.Y. Conjugates of Porphyrinoid-Based Photosensitizers with Cytotoxic Drugs: Current Progress and Future Directions toward Selective Photodynamic Therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 2022;65(3):1695–1734. doi: 10.1021/acs.jmedchem.1c01953.
- Kapinus V.N., Kaplan M.A., Yaroslavtseva-Isayeva E.V., Spichenkova I.S., Ivanov S.A. Chlorin E6-photodynamic therapy basal cell carcinoma. Research and Practical Medicine Journal (Issled. prakt. med.). 2021;8(4):33–43. (In Russ.) doi: 10.17709/2410-1893-2021-8-4-3.
- Žárská L., Malá Z., Langová K., Malina L., Binder S., Bajgar R. et al. The effect of two porphyrine photosensitizers TMPyP and ZnTPPS4 for application in photodynamic therapy of cancer cells in vitro. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2021;34:102224. doi: 10.1016/j.pdpdt.2021.102224.
- Shimolina L.E., Khlynova A.E., Gulin A.A., Elagin V.V., Gubina M.V., Bureev P.A. et al. Photodynamic therapy with Photoditazine increases microviscosity of cancer cells membrane in cellulo and in vivo. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 2024;259:113007. doi: 10.1016/j.jphotobiol.2024.113007.
- Zhao X., Liu J., Fan J., Chao H., Peng X. Recent progress in photosensitizers for overcoming the challenges of photodynamic therapy: From molecular design to application. Chemical Society Reviews. 2021;50(6):4185–4219. doi: 10.1039/D0CS00173B.
补充文件
