MORPHOFUNCTIONAL CHANGES IN RAT TESTES D U RIN G PREMATURE AGING CAUSED BY DARK DEPRIVATION

Full Text

С каждым годом в России и в мире в целом Темновая депривация оказывает негативное влияние отмечается рост частоты мужского бесплодия, одной на репродуктивное здоровье населения, в том числе из причин которого является световое загрязнение. на дифференцировку мужских половых клеток, приводя к преждевременному старению и мужскому бесплодию [2, 4]. Одним из факторов, приводящий к развитию морфофункциональных нарушений органов мужской репродуктивной системы на фоне темновой депривации является дефицит выработки мелатонина. Это приводит к уменьшению количества вырабатываемых сперматозоидов и их качества, изменения уровня мужских половых гормонов, что оказывает прямое влияние на фертильность. Ускоренное старение, вызванное световым десинхронозом, воздействует на мужскую фертильность целым рядом факторов, которые в настоящее время до конца не изучены [1, 3]. Эти факты указывают на необходимость проведения дополнительных исследований для выяснения причин репродуктивных отклонений, изучения механизмов и поиска профилактических средств коррекции. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Выявить морфологические изменения семенников у крыс при преждевременном старении, вызванном темновой депривацией. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование выполнено на 49 беспородных белых крысах самцах в возрасте 4 мес. Эксперименты проводили в соответствии с правилами лабораторной практики РФ (ГОСТ 33044-2014). Животные содержались по 5 особей в клетке (РР-4 клетка для лабораторных крыс, 466 * 314 * 200 мм; Fengshi, Китай) в стандартных лабораторных условиях при 22-24 °С и относительной влажности воздуха 40-50 %. Все процедуры с животными проводились в соответствии требованиями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза от 22.09.2010. Были сформированы 3 группы животных: 1) контрольная группа крыс, которые не подвергались темновой депривации - негативный контроль (п = 24); 2) контрольная группа животных, которые подвергались темновой депривации - позитивный контроль (п = 26); 3) опытная группа животных, которые после темновой депривации получали лечебный курс мелатонина (п = 16). Ускоренное старение в опытной группе и позитивного контроля моделировали путем 30-дневной темновой депривации в условиях постоянного искусственного освещения (300 Люкс). Животные группы негативного контроля находились при 12-часовом искусственном свето-темновом освещении. По окончании 30-дневной темновой депривации животные опытной группы ежедневно в одно и то же время (20:00 МСК) перорально (внутрижелудочно через зонд) получали мелатонин в течение 14 суток. Животные позитивного и негативного контроля получали в течение 14 суток 2%-ю крахмальную слизь в эквивалентном объеме. С целью забора крови животных для определения содержания в сыворотке мелатонина и белка Клото наркотизировали путем однократного внутрибрюшинного введения хлоралгидрата (400 мг/кг) в воде очищенной в объеме 10 мл/кг. Забор крови осуществляли из брюшной аорты крыс. После забора крови животных подвергали эвтаназии декапитацией с помощью гильотины (ООО «Открытая наука», Москва, Россия). Для стабилизации крови использовали 3,8%-й водный раствор цитрата натрия в соотношении 9:1. Для исследования уровня мелатонина и белка Клото получали сыворотку крови путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 20 мин. Аликвоты сыворотки крови замораживали и хранили при температуре -20 °С. С помощью твердофазного иммуноферментного анализа проводилось определение в сыворотке крови концентрации мелатонина и белка Клото. Иммуноферментный анализ проводили с использованием набора реактивов ELISA Kit for KLotho (KL) производства CLOUD-CLONE CORP. (США) на автоматическом микропланшетном фотометре Sunrise TS4TECAN (Tecan Austria GmbH, Австрия). Для исследования морфологического состояния репродуктивной системы самцов крыс производили забор семенников. Ткань семенников помещали в 10%-й забуференный формалин с последующей автоматизированной гистологической проводкой (Leica TP1020) и окраской гематоксилином и эозином. Микрофотосъемка гистологических микропрепаратов проводилась с помощью микроскопа Leica DM 1000 (Leica Microsystems GmbH, Германия) и программного комплекса LAS v.4.7. В каждом поле зрения измерялась толщина сперматогенного эпителия, площадь извитых семенных канальцев, площадь интерстициальной соединительной ткани. Статистическую обработку результатов проводили с использованием рангового однофакторного дисперсионного анализа Краскела - Уоллиса с апостериорным критерием Данна при помощи программы GraphPad Prism 8.0. Для проверки распределения на нормальность использовали критерий Шапиро -Уилка. Статистически значимыми расценивались изменения при p < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При гистологическом исследовании препаратов семенников крыс, подвергнутых воздействию темновой депривации, выявлены морфологические изменения, характеризующиеся изменением паренхимы и стромы семенников в отличие от группы негативного контроля (рис. А). Так, со стороны эпителия извитых семенных канальцев наблюдалась десквамация клеток сперматогенного эпителия, затрагивающего популяции сперматоцитов I и II порядков, что сопровождалось уменьшением толщины сперматогенного эпителия на 26,3 % (р < 0,001). Сперматоциты I порядка располагались неравномерно, сохраняя свои морфологические характеристики и прилежали к сперматогониям, которые, в свою очередь, находились непосредственно у базальной мембраны канальцев при наличии пространства между слоем клеток за счет выраженного отека (рис. Б). Следует отметить, что сперматоциты II порядка наблюдались не во всех канальцах и заметно снижалось их количество, что свидетельствует о гипотрофии, а в отдельных случаях и атрофии сперматогенного эпителия. Единичные сперматиды в просвете канальца соответствовали расположению пирамидных клеток Сертоли, где их популяция сохраняла свою численность и расположение. Наряду с этим, наблюдался отек как со стороны сперматогенного эпителия, так и со стороны интерстициальной ткани, где просматривались оптически пустые пространства различной степени выраженности. Сосуды микроциркуляторного русла имели выраженное полнокровие. При морфометрическом анализе наблюдалось уменьшение площади извитых семенных канальцев на 1,7 % (р < 0,05) по сравнению с показателем крыс групп негативного контроля, что подтверждалось повышением соотношения площади интерстициальной ткани и извитых семенных канальцев на 26,7 % (р < 0,01). Отмечалось снижение индекса сперматогенеза на 6,25 % по сравнению с группой негативного контроля. При морфологическом анализе семенников крыс, получавших мелатонин, выявлено, что половые клетки в извитом семенном канальце расположены в соответствии со стадиями сперматогенеза. В данном случае просматривались все клеточные популя-ц и и сперматогенного эпителия, где у базальной мембраны располагались мелкие округлые гиперхромные клетки (сперматогонии) с незначительными признаками отека, проявляющегося в наличии пространств между базальной мембраной и сперматогенным эпителием (рис. В). Сохранялась стратификации эпителия в формировании слоев сперматоцитов I и II порядков, наблюдалось восстановление толщины сперматогенного эпителия с ее увеличением на 26,6 % (р < 0,001) по сравнению с группой негативного контроля, а также повышение индекса сперматогенеза на 3 %. Клетки Сертоли имели пирамидную форму и прилежали к базальной мембране, сохраняя свою связь со сперматидами, которые частично определялись в просвете канальца. При оценке площади извитых семенных канальцев было установлено, что она увеличивалась на 1,5 % (р < 0,05). Наряду с этим, наблюдалось уменьшение соотношения площади интерстициальной ткани и извитых семенных канальцев на 18,6 % (р < 0,01). Рис. Срез семенника крысы. А - негативный контроль, Б - позитивный контроль, В - опытная группа. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув. *20 Морфологические изменения в семенниках крыс в условиях темновой депривации свидетельствуют о преждевременном старении, что также подтверждается снижением уровня белка Клото у животных позитивного контроля по отношению к уровню негативного контроля в 1,7 раза. Однако полного восстановления уровня белка Клото в крови у опытных животных, получавших мелатонин, не наблюдалось, значение данного показателя было у них статистически не значимо меньше, чем у крыс негативного контроля в 1,36 раза. Снижение показателя соотношения площади интерстициальной ткани и извитых семенных канальцев свидетельствует о восстановлении уровня активности сперматогенеза. Таким образом, темновая депривация в течение 30 сут., используемая как одна из наиболее адекватных моделей преждевременного старения репродуктивной системы, приводит к статистически значимым гистоморфологическим изменениям в структуре семенников - уменьшению площади извитых семенных канальцев, истончению сперматогенного эпителия и истощению популяций половых клеток, что может свидетельствовать об угнетении сперматогенеза. Введение экзогенного мелатонина, 14-суточным курсом, создает необходимые условия для ремоделирования сперматогенного эпителия извитых семенных канальцев, восстановления численности мужских половых клеток и увеличения площади извитых семенных канальцев. Однако необходимо более детальное изучение популяций половых клеток. Старение мужской репродуктивной системы характеризуется снижением функций яичек и надпочечников и приводит к снижению концентрации андрогенов. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, темновая депривация оказывает негативное влияние на морфофункциональное состояние репродуктивной системы самцов крыс, проявляющееся нарушениями сперматогенеза в семенниках крыс, снижением уровня белка Клото. Введение мелатонина экспериментальным животным приводит к коррекции нарушений генеративной функции семенников, увеличению уровня белка Клото. Полученные данные об особенностях гистологического строения семенников при воздействии 30-суточной темновой депривации и последующей коррекции мелатонином расширяют имеющиеся представления о причинах, вызывающих нарушения сперматогенеза и его регуляции. Прием мелатонина в течение 14 сут. способствует восстановлению сперматогенного эпителия, увеличению белка Клото в сыворотке крови животных, что указывает на протективное действие мелатонина на морфофункциональное состояние животных после 30-суточной темновой депривации.

About the authors

L. I Kondakova

Volgograd State Medical University

Email: larisakondakova@gmail.com
Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Associate Professor of the Department of Histology, Embryology, Cytology Volgograd, Russia

S. A Kalashnikova

Volgograd State Medical University

Email: kalashnikova-sa@yandex.ru
Doctor of Medical Sciences, Associate Professor, Head of the Department of Anatomy Volgograd, Russia

L. V Polyakova

Volgograd State Medical University

Email: lvpolyakova7@gmail.com
Candidate of Medical Sciences, Associate Professor Volgograd, Russia

M. V Bukatin

Volgograd State Medical University

Email: buspak76@mail.ru
Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Department of Fundamental Medicine and Biology Volgograd, Russia

References

Supplementary files