VALIDATION OF QUANTITATIVE METHOD OF DETERMINING FLAVONOIDS IN INULA BRITANNICA HERB

Full Text

Девясил британский (Inula britannica L.) - популярное в последнее время за рубежом растение. Оно используется как отхаркивающее [5], тонизирующее, общеукрепляющее, повышающее сопротивляемость организма и стимулирующее обмен веществ средство при перитоните, головной боли, симптомах нарушения мозгового кровообращения, сильном переутомлении, желудочных коликах, злокачественных опухолях, пневмониях, а также при сухом кашле, подагре, атеросклерозе, ревматизме, тахикардии, нефрите [3]. Основными действующими веществами травы девясила британского являются сесквитерпены и фла-воноиды, которые представлены бициклическими сес-квитерпеноидами (сесквитерпеновыми лактонами) и флавонами, флавонолами соответственно [3, 5]. Именно с этими классами биологически активных соединений связывают противокашлевое, местное ранозаживляющее действие, антибактериальную и антифунгаль-ную, цитотоксическую [3] активности надземной части девясила британского. Выпуск 3 (47). 2013 47 Отечественное сырье, с научной точки зрения, изучено мало, хотя в народной медицине растение применяется при длительно незаживающих ранах, геморрое, поносах и кровотечениях, глистной инвазии. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Ввалидационная оценка методики количественного определения флавоноидов в траве девясила британского (Inula britannica L), произрастающего в Волгоградской области, методом спектрофотометрии для обоснования возможности ее использования для количественного анализа исследуемого сырья. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования выступала трава девясила британского, заготовленная в фазу полного цветения (июль-август 2010 г.) от дикорастущих популяций во Фроловском районе Волгоградской области. Все использованные в работе реактивы имели степень чистоты ч.д.а. В основу количественного определения флавоноидов в сырье положен метод дифференциальной спек-трофотометрии, основанный на способности флавонои-дов образовывать окрашенные хелатные комплексы со спиртовым раствором алюминия хлорида в среде кислоты хлороводородной разведенной. При этом наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы поглощения от 330-350 нм и основной максимум поглощения отмечается при 390-410 нм [2]. Валидация методики определения флавоноидов в траве девясила британского выполнена в соответствии с рекомендациями [1, 4] по следующим характеристикам: правильность, прецизионность, специфичность, линейность, аналитическая область (диапазон применения). Правильность оценивали по результатам шести определений на одном уровне концентрации. Прецизионность методики характеризуется рассеянием результатов, получаемых с ее использованием, относительно величины среднего результата. Мерой такого рассеяния является величина стандартного отклонения результата отдельного определения, полученная для выборки достаточно большого объема. Прецизионность может оцениваться в трех вариантах: - как повторяемость (сходимость); - как внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность; - как межлабораторная прецизионность (воспроизводимость). Результаты оценки методики анализа по каждому из вариантов прецизионности характеризуются соответствующим значением величины стандартного отклонения результата отдельного определения с указанием числа степеней свободы. При разработке оригинальной методики определяется повторяемость (сходимость) результатов, получаемых с ее использованием. При необходимости включения разработанной методики в нормативную докумен тацию дополнительно определяется ее внутрилабора-торная (промежуточная) прецизионность. Сходимость устанавливали по результатам анализа одного образца в 6 повторностях. Воспроизводимость подтверждали на 3 образцах одной серии сбора. Извлечения из травы девясила британского были протестированы в разные дни на трех спектрофотометрах (марки «СФ-46», «UV-1700 Shimadzu» и «Spekol И») разными аналитиками, каждым из которых было проведено по 6 определений. Внутрилабораторную прецизионность оценивали методами попарных сравнений и однофакторного дисперсионного анализа (по критерию Фишера). Полученные экспериментальные значения сравнивали с табличной величиной F-критерия. Статистическая обработка результатов проводилась согласно ОФС 42-0111-09 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента» и включала проверку однородности выборки с последующим вычислением базовых статистических показателей, характеризующих вариационные ряды, с использованием пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft, США) и Excel 2000 (MS Office 2000, США). Варианты, отягощенные грубыми ошибками, идентифицировали исходя из размаха варьирования. Метод дифференциальной спектрофотометрии, основанный на реакции комплексообразования флавонои-дов с алюминия хлоридом, является достаточно доступным, надежным и распространенным методом их определения. Данная реакция как довольно специфическая очень часто используется в методиках количественного определения, так как данный подход позволяет минимизировать вклад сопутствующих веществ в оптическую плотность исследуемых растворов. Специфичность (селективность) методики подтверждалась совпадением максимумов и минимумов поглощения раствора СО и извлечения из травы девясила британского, а также отсутствием максимумов поглощения в спектре поглощения раствора «плацебо» (вода очищенная). Линейность методики устанавливали традиционно путем статистической обработки выборки, полученной в результате анализа трех проб на восемнадцати уровнях концентраций в диапазоне 4-150 % от количества флавоноидов, принятого за 100 %, на серии разведений экстракта (от 1 : 25 до 1,5 :1). На основании полученных данных строили график зависимости оптической плотности комплекса флавоноидов с алюминия хлоридом от концентрации флавоноидов, после чего определяли участок линейности и пределы обнаружения. Коэффициенты а и b и метрологические характеристики зависимости между х и у рассчитывали с использованием регрессионного анализа методом наименьших квадратов по экспериментально измеренным значениям переменной у для заданных значений аргумента х. Наличие линейной зависимости между х и у (х - концентрация флавоноидов, %; y - оптическая плотность) подтверждали расчетным путем по экспериментальным данным, полученным при калибровке, с 48 Выпуск 3 (47). 2013 использованием корреляционного анализа согласно ОФС 42-0111-09 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента». Для определения линейности методики строили график зависимости оптической плотности от концентрации флавоноидов. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты определения правильности представлены в табл.1. Таблица 1 Метрологическая характеристика результатов количественного определения флавоноидов в траве девясила британского (n = 6, P = 95 %) Объект А ДА f S S2 S, % єед., % Трава девя 0,741 0,001 5 0,001 0,0000011 0,15 0,37 сила британского Данные табл. 1 подтверждают, что полученные значения относительного стандартного отклонения при количественном определении флавоноидов в траве девясила британского методом спетрофотометрии не превышают ±2 %, что соответствует требованиям нормативной документации [4]. Следовательно, полученные результаты подтверждают правильность методики, используемой для анализа данной группы биологически активных веществ в исследуемом сырье. Метрологические характеристики трех выборок представлены в табл. 2. Таблица 2 Метрологическая характеристика методики определения суммы флавоноидов в траве девясила британского Сравнение дисперсий S21, S22 и S23 с помощью критерия Фишера (критерий Фишера F = 1,03 < F = гг г \ г г г расч > теор 5,05 и F = 1,38 < F = 5,05 при Р = 99 %) показало, ’ расч ’ теор > г / > что они значимо не отличаются друг от друга, поскольку рассчитанное значение критерия Фишера меньше табличного, следовательно, значения результатов анализа, полученные двумя аналитиками, можно отнести к одной и той же выборке. Результаты сравнения дисперсий полученных выборок по Фишеру свидетельствуют о статистической однородности последних. Статистическая обработка показала, что различие между дисперсиями и между средними статистически не значимо, подтвердив удовлетворительную прецизионность методики. График зависимости оптической плотности от концентрации флавоноидов представлен на рис. 0,04 0,05 0,06 0,09 0,19 0,31 0,37 0,46 0,55 0,66 0,71 0,84 0,93 1,02 1,11 1,20 1,30 1,39 Концентрация флавоноидов, % Рис. Градуировочный график зависимости оптической плотности извлечений из травы девясила британского от концентрации флавоноидов Из рис. следует, что в извлечениях из травы девясила британского наблюдается линейная зависимость оптической плотности от концентрации флавоноидов в интервале от 0,09 до 1,39 %, коэффициент корреляции имеет значение г > 1,00 и подтверждает достоверность линейной зависимости функции от аргумента. Это доказывает пригодность разработанной методики по параметру «линейность». Диапазон экспериментальных данных, удовлетворяющих линейной модели зависимости оптической плотности извлечений из травы девясила британского от концентрации флавоноидов и подчиняющихся закону Бугера-Ламберта-Бера, составляет от 10 до 150 % от номинального содержания биологически активных веществ в извлечениях травы девясила британского, таким образом, указанный интервал концентраций может быть признан аналитической областью методики. Поскольку валидируемая методика проводится в легко контролируемых условиях анализа, то нет необходимости определять ее устойчивость. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Была проведена валидационная оценка методики количественного определения флавоноидов в траве девясила британского, в результате чего установлено, что все значения проверенных показателей укладываются в допустимые пределы, а используемый метод позволяет получать стабильные воспроизводимые и достоверные результаты. Таким образом, предложен Выборка 1 2 3 Сумма флавоноидов, % 0,925 0,911 0,933 0,926 0,913 0,931 0,926 0,913 0,930 0,926 0,914 0,933 0,928 0,914 0,934 0,929 0,915 0,930 Метрологические характеристики 1 2 3 4 Хср. 0,927 0,914 0,932 АХ 0,001 0,001 0,002 S 0,0013 0,0013 0,0015 S2 0,0000017 0,0000017 0,0000023 S, % 0,15 0,15 0,17 &ед., % 0,37 0,39 0,44 У - - - Критерий Фишера F (P = 95 %; f = 5) = 5,05 - 1,03 1,38 Выпуск 3 (47). 2013 49 ная методика валидна по показателям специфичность, линейность и аналитическая область методики, правильность и воспроизводимость и может быть использована для количественного определения флавоноидов в исследуемом сырье.

About the authors

A. V. Yanitskaya

I. Yu. Mitrofanova

Email: I.U.Mitrofanova@yandex.ru

References

Supplementary files