ГИСТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТКАНИ ПЕЧЕНИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ФИБРОЗЕ ХИМИЧЕСКОГО ГЕНЕЗА

Аннотация

Было проведено моделирование фиброза печени, индуцированного четыреххлористым углеродом и этанолом. Обнаруженные изменения в гистоэнзимологическом профиле печеночной ткани свидетельствуют о метаболических сдвигах в гепатоцитах в сторону усиления процессов аэробного гликолиза.

Полный текст

Фиброз печени - широко распространенное заболевание, одной из причин которого является хроническая интоксикация [3]. Среди токсикантов, обладающих гепатотоксическим и фибротическим действием находятся хлорированные углеводороды, спирты, альдегиды и другие соединения. Данное заболевание сопровождается снижением всех основных функций органа, а при прогрессировании трансформируется в цирроз с дальнейшей малигнизацией. Значительное место в диагностике и оценке эффективности терапии при фиброзе печени занимают исследования молекулярных механизмов образования внеклеточного матрикса, регулирование скорости его синтеза и деградации. В клинической и экспериментальной практике используют несколько биомаркеров фиброза печени, определяемых в плазме крови [1]. Однако изменение гистоэнзимологического профиля печени не всегда коррелирует с биохимическими параметрами сыворотки крови. Применение гистохимических методов позволяет выявить количественные изменения, происходящие с ферментами и субстратами Выпуск 4 (48). 2013 27 в неразрывной связи с клеточными или тканевыми структурами исследуемого органа. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучение направленности метаболических путей в печеночной ткани при экспериментальном фиброзе печени химического генеза с применением гистохимических методов. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Моделирование фиброза печени Эксперимент проводили на беспородных белых крысах-самцах весом 220-270 г. Крыс содержали в клетках по 8 особей в каждой в помещениях с искусственным освещением (8.00-20.00 ч. - свет, 20.00-8.00 ч. - темнота) при 20-22 оС в условиях свободного доступа к воде и пище. Животные были поделены на две группы: контроль и опыт. При моделировании фиброза печени на белых крысах принималось во внимание наличие у них мощной ре-паративной системы, поэтому первостепенное значение придавалось стойкости фибротических изменений [4, 5]. В связи с этим нами была выбрана модель фиброза с хроническим введением четыреххлористого углерода (ЧХУ) на фоне постоянной алкоголизации. Эксперимент проводили по следующей схеме. За 7 дней до начала введения ЧХУ животным в качестве питья начинали давать 5%-й водный раствор этанола ad libitum. Раствор ЧХУ в растительном масле в соотношении 1:3 вводили внутрижелудочно через зонд дважды в неделю в дозе 0,1 мл/100 г массы тела в течение 8 недель. В течение всего периода индуцирования фиброза печени крысам в качестве питья давали 5%-й раствор этанола. По данным патогистологического исследования, у подопытных животных развивался выраженный фиброз печени с наличием порто-портапьных и порто-центральных септ и образованием ложных долек (рис. 1). Степень фиброза печени по шкале METAVIR составляла 3 балла. Рис. 1. Ткань печени крысы через 8 недель после начала эксперимента. Фиброзные порто-портальные и порто-центральные септы. Образование ложных долек. Баллонная дистрофия гепатоцитов. Окраска по Masson. Исходное увеличение х 100 2. Гистохимическое исследование Материалом для гистохимического исследования служила ткань печени интактных и подопытных животных. Образцы тканей подопытных и контрольных животных, предназначенные для гистохимического исследования, помещали на один блок, замораживали при температуре -18-20 °С и резали в криостате. Полученные срезы монтировали на одно предметное стекло и инкубировали. В данной работе были использованы следующие методы: определение активности щелочной фосфатазы (ЩФ), кислой фосфатазы (КФ), сукцинатдегидрогеназы (СДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), малатдегидрогеназы (МДГ), цитохромоксидазы (ЦХО), липазы, а также определение содержания гликогена и нейтральных липидов [2]. Полученные препараты изучали и фотографировали с помощью микроскопа AxioScopeA1 (Zeiss), оборудованного цифровой камерой AxioCam MRc5 и обрабатывали в программе ZENpro 2011 (Zeiss). Активность гистохимических реакций определялась в условных единицах как Log10(Fin/Fout) в 4 полях зрения. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Statistica 7.0 с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Гистохимический анализ показал достоверное увеличение активности ЩФ, липазы, ЦХО, а также СДГ и МДГ (табл., рис. 2). При этом уровень гликогена и активность КФ и ЛДГ оставались неизменными (статистически незначимыми). Также отмечали мелкокапельный стеатоз гепатоцитов по периферии печеночных долек (рис. 3). Изменение активности ферментов в ткани печени при экспериментальном фиброзе (M ± а) Исследуемый параметр Контроль Опыт Гликоген 0,343 ± 0,041 0,335 ± 0,028 Липаза 0,250 ± 0,071 0,334 ± 0,081 *Т МДГ 0,366 ± 0,070 0,484 ± 0,052*Т СДГ 0,572 ± 0,070 0,690 ± 0,053*Т ЛДГ 0,583 ± 0,122 0,608 ± 0,076 ЦХО 0,506 ± 0,040 0,534 ± 0,035*Т КФ 0,498 ± 0,054 0,524 ± 0,055 ЩФ 0,172 ± 0,017 0,231 ± 0,032*Т *р < 0,01. Активация ЩФ, являющейся маркерным ферментом желчных протоков, свидетельствовала об ее избыточном накоплении в гепатоцитах вследствие нарушения экскреции данного фермента в систему желчных протоков. Причиной этого могла являться как внутриклеточная патология гепатоцитов, так и деформация архитектоники билиарных сосудов при фиброзе печени. Увеличение активности липазы в сочетании с неизмененным уровнем гликогена служило признаком того, что в качестве биоэнергетического ресурса гепатоци-тов были задействованы липиды, накапливающиеся в паренхиме печени. 28 Выпуск 4 (48). 2013 [ЩсшгГ №Щ Контроль Опыт Гликоген ЩФ КФ Липаза ЦХО ЛДГ СДГ Щелочная фосфатаза а Median □ 25%-75% □ 25%-75% МДГ Рис. 2. Изменение гистохимического профиля ткани печени крыс при экспериментальном фиброзе печени. Исходное увеличение х100 M 25 Выпуск 4 (48). 2013 29 Рис. 3. Хроническая интоксикация ЧХУ в течение 8 недель. Стеатоз гепатоцитов, расположенных по периферии печеночной дольки. Окраска Суданом III-IV. Исходное увеличение х100 Отсутствовали изменения в активности ЛДГ, которая катализирует реакцию восстановления пировиног-радной кислоты до лактата в отсутствии кислорода, следовательно, весь пируват, образовавшийся при расщеплении триглицеридов, поступал в цикл Кребса. Косвенным признаком усиления цикла трикарбоновых кислот являлось одновременное увеличение активности СДГ (20%) и ЦХО (5,5%), которые имеют исключительно митохондриальную локализацию, а также МДГ (на 32%), присутствующей в клетке в виде цитозольного и митохондриального изоферментов. При изучении гистохимических препаратов обращало на себя внимание, что кроме количественного увеличения активности ферментов происходили изменения в топографии их распределения в паренхиме печени. Так, если у интактных животных участки с вы сокой биохимической активностью локализовались в центральной части печеночной дольки, то у животных с индуцированным фиброзом происходило смещение энзиматической активности в гепатоцитах к периферии печеночных долек, где они обнаруживались в областях, непосредственно прилегающих к септам. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, полученные данные свидетельствуют о значительных метаболических сдвигах в ге-патоцитах при экспериментальном фиброзе печени химического генеза в сторону активации процессов аэробного гликолиза с перемещением зон наибольшей метаболической активности гепатоцитов к периферии печеночных долек.