ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУР ЛИМФОЦИТОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ДЛЯ ОЦЕНКИ И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

Аннотация

Показана возможность прогнозирования токсических свойств физиологически активных веществ для человека с использованием культур лимфоцитов человека и лабораторных животных. На основании экспериментальных данных получены математические модели прогноза токсичности изучаемых соединений для человека.

Полный текст

В настоящее время все большее значение в исследованиях токсичности различных классов физиологически активных веществ (ФАВ) приобретают методы с использованием культур клеток и тканей [2, 4]. Подобный подход является достаточно популярным, так как позволяет значительно экономить время и уменьшить количество используемых в эксперименте лабораторных животных. Еще одно преимущество данного способа изучения токсичности заключается в том, что имеется возможность работы с культурами клеток и тканей человека, в то время как большинство токсикологических исследований и изучение механизма действия ФАВ на человеческом организме невозможны. Особое внимание ряда исследователей привлекают иммунокомпетентные клетки, и, в частности, лимфоциты [1, 5]. Это связано как с высокой чувствительностью клеток иммунной системы к воздействию химических соединений, так и с тем фактом, что данная популяция иммунокомпетентных клеток может быть относительно легко и в достаточном для исследований количестве выделена как у лабораторных животных, так и у человека. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Оценка возможности прогнозирования токсикомет-рических параметров химических веществ для человека по совокупности токсикологических и цитотокси-ческих показателей. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использованы Т-2 токсин, афлаток-син В1 и охратоксин А фирмы «Sigma», а также иприт, люизит и 2,3,7,8-тетрахлордибензо-пара-диоксин (2,3,7,8-ТХДД, диоксин), содержащие не менее 95 % основного вещества. Эксперименты проведены на нелинейных белых мышах, мышах линий C57Bl/6 и CBA, белых нелинейных крысах. При работе с экспериментальными животными руководствовались требованиями приказа Минздрава СССР №755 от 12.08.1977 г. Животных выводили из эксперимента передозировкой диэтилового эфира. Помимо этого, для исследования цитотоксичности ФАВ использовалась кровь здоровых доноров, отобранная в асептических условиях. Оценка цитотоксических свойств ФАВ на культурах лимфоцитов лабораторных животных и человека проводилась в опытах in vitro. Селезенку экспериментальных животных выделяли в стерильных условиях, клеточную суспензию получали в гомогенизаторе Поттера. Лимфоциты из периферической крови и селезенки выделяли в градиенте плотности по Boyum [3]. Рабочая концентрация лимфоцитов крови человека и спленоцитов экспериментальных животных составила 2 • 106 клеток в 1 мл. Количество жизнеспособных клеток - не менее 95 %. Культивирование клеток проводили в 96-луночных планшетах в среде RPMI1640 с добавлением 10%-й фетальной сыворотки, 2мМ L-глютамина, 100 мкг/мл гентамицина и 2Ч0-5 М 2-меркаптоэтанола в течение 68 ч в атмосфере, содержащей 5 % СО2 при 100 % влажности. Затем в культуры добавляли изучаемые соединения в различных концентрациях. Инкубация культур клеток с исследуемыми вещества Выпуск 4 (48). 2013 113 ми составляла 4 ч. В последующем в каждую лунку добавляли по 1 мкКи [3Н]-тимидина (молярная активность 40...60 Ки/моль) на 2 ч. Подсчет активности проб производился жидкостно-сцинтилляционным методом. Среднеэффективную концентрацию (ЕС50) определяли по степени ингибирования синтеза ДНК в культурах лимфоцитов с оцениваемыми ФАВ по сравнению с контрольными культурами, содержащими только растворитель. В качестве растворителя использовали диметилсульфоксид, разведенный культуральной средой до 1%-й концентрации, которая, как было предварительно установлено, не влияет на уровень синтеза ДНК в лимфоцитах. Величины ЕС50 рассчитывали пробит-методом по соответствующей программе. Показатели острой токсичности исследуемых токсикантов оценивалипри их внутривенном введении. Величины LD50 рассчитывали пробит-методом по соответствующей программе. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Данные по цитотоксическим свойствам изученных соединений представлены в табл. 1. Таблица 1 Цитотоксические свойства ФАВ для лимфоцитов млекопитающих Из представленных в табл. 1 данных видно, что наибольшей токсичностью для культур лимфоцитов лабораторных животных и человека обладают Т-2 токсин и люизит, в то время как значительно меньшие цитотоксические свойства по отношению к культурам лимфоцитов наблюдаются у афлатоксина В1, иприта и диоксина. Наблюдается значительная межвидовая вариабельность цитотоксичности изученных токсикантов, максимальные различия которой выявлены в случае воздействия люизита (до 70 раз) и 2,3,7,8-ТХДД (до 53 раз). Помимо этого, отмечены существенные колебания внутривидовой чувствительности лимфоцитов к ФАВ (табл. 2). Так, различия в цитотоксичности исследуемых соединений для лимфоцитов мышей двух линий (C57BI/6 и CBA) составляют от 1,7 до 26,3 раз. Важнейшим аспектом использования полученных в ходе исследований in vitro результатов по чувствительности клеточных культур является возможность прогнозирования на их основе токсичности изучаемых соединений для человека. При этом на основе полученных in vitro данных по цитотоксичности ФАВ для культур лимфоцитов животных и человека и результатов токсикологической оценки химических веществ in vivo могут быть получены математические модели прогноза токсичности изучаемых соединений для человека. Пример подобного расчета приведен на рис., где описана зависимость между ЕС50 и LD50 иприта. Таблица 2 Цитотоксические свойства ФАВ для лимфоцитов различных линий мышей ФАВ Значения ЕС50 для культур лимфоцитов, мг/мл Интен сивность различий, раз мыши C57BI/6 мыши CBA Афлаток-син В1 5,2 • 10-4 6,8 • 10-4 1,7 Т-2 токсин 3,3 • 10-5 1,6 • 10-5 2,1 2,3,7,8- ТХДД 1,6 • 10-2 2,5 • 10-1 15,6 Охраток-син А 5,0 • 10-2 1,9 • 10-3 26,3 Рис. Зависимость между острой токсичностью и цитотоксичностью иприта Вычисленная по приведенному на рис. уравнению LD50 иприта для человека при внутривенном введении составляет 10,66 мг/кг. Аналогичные расчеты были проведены для Т-2 токсина, охратоксина А, люизита и 2,3,7,8-ТХДД. Расчетные среднесмертельные дозы этих веществ для человека и уравнения регрессии, полученные на основании исследований in vitro и in vivo представлены в табл. 3. Исследуе мые соединения Концентрация, вызывающая 50 % угнетение синтеза ДНК, ЕС50, мг/мл мыши нелинейные крысы нелинейные человек Т-2 токсин 1,4 • 10-7 5,9 • 10-7 1,1 • 10-7 Люизит 8,0 • 10-8 1,9 • 10-7 5,6 • 10-6 Иприт 2,2 • 10-3 9,9 • 10-5 7,3 • 10-4 Афлаток-син В1 4,0 • 10-4 7,5 • 10-4 2,3 • 10-4 2,3,7, 8-ТХДД 1,6 • 10-2 3,2 • 10-1 6,0 • 10-3 114 Выпуск 4 (48). 2013 ©згйирСз [ЩсоЩгІГІЩІ Таблица 3 Расчетные параметры LD50 исследованных ФАВ для человека Иссле дуемые соеди нения Расчетная величина LD50, мг/кг Уравнение регрессии Иприт 10,66 LD50 = 3,8580+13650,78 • ЕС50 Т-2 токсин 3,17 LD50 = 3,5545-3455442,75 • ЕС50 Охра-токсин А 4,12 LD50 = 4,1167-23,39 • ЕС50 Люизит 9,19 LD50 =6,4763+311543,23 • ЕС50 2,3,7,8-ТХДД 0,05 LD50 = 0,0309+3,7666 • ЕС50 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, культуры иммунокомпетентных клеток млекопитающих, в частности лимфоцитов, могут широко применяться в токсикологических исследованиях при получении исходных данных, необходимых для прогнозирования токсикометрических показателей ФАВ для человека. Предлагаемые методы могут быть использованы и при оценке фармакологической активности новых лекарственных средств при проведении их доклинических и клинических исследований. При менение клеточных культур позволяет значительно ускорить и удешевить токсикологическую оценку вновь синтезируемых химических веществ за счет снижения количества используемых экспериментальных животных и повышения производительности метода с учетом современных способов детекции жизнеспособности клеток в культуре.