POLYMORPHISM OF GENES OF TOLL-LIKE RECEPTORS AND SERUM LEVELS OF PRO-INFLAMMATORY CYTOKINS IN PREGNANT WOMEN WITH FETAL LOSS SYNDROME IN THE PAST MEDICAL HISTORY

Full Text

Роблема невынашивания беременности является одной из наиболее актуальных в современном акушерстве. Высокая частота ее возникновения обуславливает необходимость поиска путей предотвращения осложнений беременности, приводящих к потере плода [2, 5, 6]. В последние десятилетия внимание исследователей привлекает роль иммунных механизмов в формировании фетоплацентарной единицы и их влияние на течение гестационного процесса. В этом аспекте имеет важное значение изучение роли механизмов врожденного иммунитета, в частности , толл-подобных рецепторов (Toll-li ke receptors (TLRs)) [3, 4, 7, 8, 9, 10]. Несмотря на то, что толл-рецепторы были открыты относительно недавно, изучена и доказана их роль в развитии ряда патологических процессов, в том числе воспаления [9, 10]. TLRs клеток моноцитарно-макрофа-гального ряда посредством передачи сигнала внутрь клетки приводят к увеличению продукции целого ряда провоспалительных цитокинов и костимуляционных молекул, которые способствуют активации Т-лимфоцитов и стимулируют развитие адаптивного иммунного ответа [7]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Сравнительный анализ особенностей распределения полиморфных локусов генов толл-рецепторов (TLR2, ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ TLR3, TLR4, TLR6, TLR9) и сывороточных уровней ИЛ-Iß, ИЛ-6, IFNy и TNFa у женщин с физиологической беременностью и с синдромом потери плода в анамнезе. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Обследовано 203 пациентки, наблюдающихся в МУЗ «Женская консультация № 5» и МУЗ «Женская консультация № 6» Волгограда. Все обследуемые были разделены на 3 группы. Группу контроля (группа 1) составили 100 небеременных соматически здоровых женщин репродуктивного возраста, группу 2 - 39 женщин с физиологическим течением беременности, группу 3-64 беременных с синдромом потери плода в анамнезе. Группы были репрезентативны по возрасту (29 ± 4,05) лет и сроку гестации (18 ± 3,2) недель. Материалом для исследования послужила периферическая кровь пациенток, полученная при плановом посещении. Цитокины определялись с помощью наборов реактивов для иммуноферментного анализа производства ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург): «ИФА-IL-6», «ИФА-ILH ß», «ИФА-IFN-gamma», «ИФА-TNF-alpha» на фотометре иммуноферментном планшетном «Эфос» 9305 (ОАО «Московский завод Сапфир», Москва). В наборах использован «сэндвич»-вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Исследование полиморфизма генов TLRs производили с помощью диагностических наборов для выявления полиморфизмов в геноме человека методом полимеразной цепной реакции «SNP-экспресс» производства НПФ «Литех»: «Мутация толл-подоб-ного рецептора 2» (ген - TLR2, полиморфизм - Arg753Gln), «Мутация толл-подобного рецептора 3» (ген - TLR3, полиморфизм - Phe412Leu), «Мутация толл-подобного рецептора 4» (ген - TLR4, полиморфизм -Asp299Glu), «Мутация толл-подобного рецептора 6» (ген - TLR6, полиморфизм - Ser249Pro), «Мутация толл-подобного рецептора 9» (ген - TLR9, полиморфизм-T-1237C). Статистические расчеты производили с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0 фирмы StatSoft, Inc. (США). Значимость различий при сравне нии групп оценивалась непараметрическим U-критерием Манна-Уитни, достоверность различия частот встречаемости оценивали с помощью критерия %2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В результате обследования выявлено, что среди женщин с синдромом потери плода в анамнезе по сравнению с женщинами, у которых беременность протекала физиологически, значимо выше частота кольпитов (44 %), сочетанных урогенитальных инфекций (19 %), эндометритов (25 %), синдрома поликистозных яичников (25 %). Кроме того, текущая беременность в исследуемой группе в 74 % случаев была осложнена угрозой выкидыша на сроках (9 ± 3,5) и (18 ± 2,27) недель, подтвержденной данными ультразвукового исследования и клиническими методами исследования. Анализ содержания провоспалительных цитокинов (ИЛ-1 ß, ИЛ-6, IFNy, TNFa) в сыворотке крови обследуемых групп женщин показал значимое увеличение количества TNFa [(18,7 ± 4,2) пг/мл, р < 0,05] в группе беременных с синдромом потери плода в анамнезе по сравнению с группой женщин с физиологическим течением беременности (7,4 ± 1,0) пг/мл и контрольной группой (4,73 ± 0,51) (табл. 1). Для нормального развития беременности определенный уровень TNFa необходим, так как он ограничивает процессы синтеза ДНК клетками трофобласта [1]. Однако гиперпродукция TNFa приводит к нарушению микроциркуляции и тканевой гипоксии, в результате происходит снижение маточно-плацентарного кровотока и нарушение метаболической, трофической, гормональной функции плаценты [6]. При исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера Arg753Gln гена TLR2 обнаружено преобладание частоты аллели Gln в группе женщин с синдромом потери плода в анамнезе (18 %) над частотой того же аллеля в группе женщин с физиологической беременностью (4 %) и контрольной группой (5 %). Кроме того, встречаемость генотипа Arg/Gln (27 %) в группе 3 преобладала над встречаемостью этого гено Таблица 1 Содержание цитокинов в сыворотке обследованных женщин Показатель, пг/мл Группа 1 небеременные соматически здоровые женщины (M ± m) n = 89 Группа 2 женщины с физиологическим течением беременности (M ± m) n = 39 Группа 3 беременные женщины с синдромом потери плода в анамнезе (M ± m) n = 64 ИЛ-^ 7,4 ± 0,8 8,00 ± 1,04 5,90 ± 0,87 ИЛ-6 5,04 ± 1,54 4,3 ± 1,1 6,3 ± 1,5 IFNy 2,18 ± 1,40 4,1 ± 1,4 4,2 ± 1,0 TNFa 4,73 ± 0,51 7,4 ± 1,0 18,7 ± 4,2*# *Статистически значимые отличия от группы 2 (p < 0,05; по U-критерию Манна-Уитни); #статистически значимые отличия от группы 1 (p < 0,05; по U-критерию Манна-Уитни). 32 Выпуск 2 (50). 2014 типа в группе 1 (9 %) и группе 2 (8 %). Количество нормальных гомозигот Arg/Arg оказалось выше в контрольной группе (90 %) и среди женщин с физиологической беременностью (92 %), чем в группе 3 (69 %) (табл. 2). Частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфного маркера гена TLR3 (Phe412Leu) и TLR6 (Ser249Pro) в исследуемых группах статистически не отличались. В группе женщин с синдромом потери плода в анамнезе аллель Gly полиморфного маркера гена TLR4 Asp299Gly встречалась чаще (25 %), чем в группе 2 (25 %) и контрольной группе (9 %). Генотип Asp/ Gly в группе 3 также встречался чаще (31 %), чем в группе 1 (14 %) и группе 2 (10 %). Нормальные гомозиготы Asp/Asp среди женщин с синдромом потери плода в анамнезе, напротив, встречались реже (67 %), чем среди женщин группы 1 (84 %) и группы 2 (87 %) (табл. 3). В группе 3 гетерозиготы ТС по полиморфному маркеру гена TLR9 (T-1237C) встречались реже (44 %), чем в группе 2 (69 %) и контрольной группе (64 %). Количество мутантных гомозигот СС в группе женщин с синдромом потери плода в анамнезе было статистически выше, чем в группе 2 (9 % против 0 % соответственно) (табл. 4). Таким образом, в ходе исследования выявлено преобладание гетерозиготного генотипа по полиморфным маркерам генов TLR2 и TLR4 в группе женщин с синдромом потери плода в анамнезе, а также большее количество мутантных гомозигот СС по полиморфному маркеру гена TLR9 в сравнении с группами 1 и 2. Также установлено наличие высокого уровня TNFa среди женщин с синдромом потери плода в анамнезе в сравнении с его уровнем у женщин с физиологической беременностью, что свидетельствуют о неустановившемся ко второму триместру иммунном балансе в системе мать-плод-плацента. Боль- Таблица 2 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера гена TLR2 Arg753Gln в исследуемых группах, (%) Показатель Группа 1 небеременные соматически здоровые женщины, n Группа 2 женщины с физиологическим течением беременности, n Группа 3 беременные женщины с синдромом потери плода в анамнезе, n Аллели 105 (82)*# Arg 189 (95) 75 (96) Gln 11 (5) 3 (4) 23 (18)*# Всего 200 78 128 Генотип 44 (69)*# Arg/Arg 90 (90) 36 (92) Arg/Gln 9 (9) 3 (8) 17 (27)*# Gln/Gln 1 (1) 0 (0) 3 (4) Всего 100 39 64 *Статистически значимые отличия по сравнению с группой 2 (p < 0,05; по критерию х2); Статистически значимые отличия по сравнению с группой 1 (p < 0,05; по критерию х2). Таблица 3 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера гена TLR4 Asp299Gly в исследуемых группах, (%) Показатель Группа 1 небеременные соматически здоровые женщины, n Группа 2 женщины с физиологическим течением беременности, n Группа 3 беременные женщины с синдромом потери плода в анамнезе, n Аллели 106 (75)*# Asp 182 (91) 72 (92) Gly 18 (9) 6 (8) 22 (25)*# Всего 200 78 128 Генотип 53 (67)*# Asp/Asp 84 (84) 34 (87) Asp/Gly 14 (14) 4 (10) 10 (31)*# Gly/Gly 2 (2) 1 (3) 1 (2) Всего 100 39 64 ‘Статистически значимые отличия по сравнению с группой 2 (p < 0,05; по критерию х2); Статистически значимые отличия по сравнению с группой 1 (p < 0,05; по критерию х2). Выпуск 2 (50). 2014 33 Таблица 4 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера гена TLR9 (T-1237C) в исследуемых группах, (%) Показатель Группа 1 небеременные соматически здоровые женщины, n) Группа 2 женщины с физиологическим течением беременности, n Группа 3 беременные женщины с синдромом потери плода в анамнезе, n Аллели T 130 (65) 51 (65) 88 (72) C 70 (35) 27 (35) 40 (28) Всего 200 78 128 Генотип TT 33 (33) 12 (31) 30 (47) TC 64 (64) 27 (69) 28 (44)*# CC 3 (3) 0 (0) 6 (9)* Всего 100 39 64 ‘Статистически значимые отличия по сравнению с группой 2 (р < 0,05; по критерию х2); #статистически значимые отличия по сравнению с группой 1 (р < 0,05; по критерию х2). шой процент хронических инфекционных и неинфекционных заболеваний урогенитального тракта среди обследуемых женщин может служить важным патогенетическим фактором в нарушении иммунной реактивности при беременности и формировании угрозы выкидыша. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Выявленный повышенный уровень TNFa в сыворотке крови беременных женщин с синдромом потери плода в анамнезе, свидетельствует о наличии серьезного провоспалительного фактора в механизме развития осложнений второго триместра беременности в виде угрозы выкидыша у большинства женщин с синдромом потери плода в анамнезе. Это может быть обусловлено негативным влиянием системного воспаления на трофобласт. В большинстве случаев, увеличенный уровень TNFa в сыворотке крови женщин с синдромом потери плода в анамнезе был связан с наличием гетерозиготного аллельного варианта генов TLR2 Arg753Gln и TLR4 Asp299Gly. Аддитивный эффект такого сочетания приводит к нарушению формирования адаптивного иммунного ответа при беременности, особенно на фоне хронических воспалительных неинфекционных и инфекционных заболеваний. Это увеличивает вероятность осложнений во время беременности, в том числе приводит к синдрому потери плода. Следовательно, оценка уровней провоспалитель-ных цитокинов в сыворотке крови наряду с типировани-ем аллельных вариантов генов толл-рецепторов, позволяет своевременно предупредить развитие осложнений во время беременности, в том числе во втором триместре. Особенно значимым представляется тщательный сбор акушерско-гинекологического анамнеза и проведение исследования на этапах прегравидарной подго товки, что позволит провести своевременную профилактику нарушения течения беременности. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

L. N. Pitirimova

Email: Gatyzhskaya@mail.ru

B. Y. Gumilevskiy

E. A. Zagorodneva

References

Supplementary files