ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ДОРСАЛЬНОГО ОТДЕЛА ГИППОКАМПА КРЫС НА ЭТАПАХ СТАРЕНИЯ С УЧЕТОМ ЭКСПРЕССИИ СЕРИНОВОЙ РАЦЕМАЗЫ

Полный текст

Современное общество характеризуется постоянным увеличением продолжительности жизни, которая достигается за счет прогресса в медицинской сфере, гигиене и питании. Это приводит к сопутствующему увеличению связанных с возрастом когнитивных нарушений, которые, в настоящее время, представляют одну из главных социальных, экономических и медицинских проблем [11]. Обширные исследования когнитивных функций стареющего организма, выполненные на животных моделях, свидетельствуют о том, что ухудшение памяти связано с нарушением способности головного мозга, а в частности гиппокампа, управлять Са2+-зависимой пластичностью, что приводит к разрыву синаптических связей между нейронами. Эта пластичность является основным свойством нейронных се тей, лежащих в основе формирования памяти [6]. Воз-растзависимый дефицит синаптической пластичности, вероятно, отражает сдвиг в работе глутаматных N-ме-тил^-аспартат рецепторов (NMDA-R) [7]. Тем не менее, важность уменьшения плотности рецепторов, как это было предложено ранее [4], оспорена в исследовании линии крыс Lou/C/Jall, представляющих модель здорового старения [3]. У этих животных не наблюдалось очевидных возрастных нарушений памяти, несмотря на значительное снижение NMDA-R [8]. Интересно отметить, что нарушение активности NMDA-R и синаптической пластичности, которые отмечаются у старых крыс других штаммов [4], снижаются за счет насыщающей дозы D-серина. D-серин представляет собой эндогенный лиганд стрихнин-нечувствительного глицин-связывающего ІШторСз сайт NMDA-R [9] и синтезируется из L-изомера в ходе прямой реакции рацемизации, катализируемой сериновой рацемазой (СР), ферментом, локализованном не только в астроцитах, но и в нейронах [12]. Так как инактивация СР влияет не только на синтез D-серина, но и на индукцию NMDAR-зависимой синаптической пластичности, а максимальная концентрация NMDA-R у крыс представлена в СА1 зоне гиппокампа, то особенности экспрессии сериновой рацемазы в гиппокампе играют важную роль в процессе старения. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучение структурных изменений в СА1 и СА3 дорсального отдела гиппокампа у 12- и 24-месячных крыс с учетом экспрессии СР МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование проводилось на 20 нелинейных белых крысах-самцах в возрасте 12 и 24 месяцев (ФГПУ Питомник лабораторных животных «Рапполово») с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Были сформированы две группы по 10 животных в каждой. 1-я группа - крысы в возрасте 12 месяцев, 2-я группа - крысы в возрасте 24 месяцев. Животные содержались в стандартных условиях вивария с естественным 12-часовым све-то-темновым циклом (ГОСТ Р 50258-92). Эвтаназию проводили с помощью гильотинного метода с использованием «Гильотины для крыс» (AE0702, производитель «Open Science»). Головной мозг фиксировали в нейтральном забуференном 10%-м формалине. Парафиновые срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, тионином по методу Ниссля. Определяли степень повреждения нейронов методом подсчета удельного количества сморщенных нейронов с гиперхроматозом цитоплазмы. Экспрессию СР определяли иммуногис-тохимическим методом с использованием полимерной системы (Thermo Scientific, Fremont, CA). В качестве первичных антител использовали моноклональные мышиные антитела к СР (Santa Cruz, Biotechnology, Inc. 1:50). Оценку изменений уровня экспрессии СР определяли путем подсчета удельного количества иммуно-позитивных нейронов, определения относительной площади иммунопозитивного материала в СА1 и СА3 с использованием программы «Видеотест-Морфо-4» (Россия), а также интенсивности окрашивания в баллах от 0 до 3 (0 - иммунонегативная реакция; 1 - слабо выраженное окрашивание; 2-умеренно выраженное окрашивание; 3 - максимально выраженное окрашивание). Исследование микропрепаратов проводилось с помощью микроскопа «Micros» (Austria), фотодокументирование осуществляли камерой «Olympus» (Japan). Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов программ Statistica 6,0 (StatSoft, USA). Обобщенные данные представляли в виде медианы (Me) с указанием интерквартильного интервала [Q1 ; Q3], где Q1 - 25 процентиль, Q3 - 75 процентиль. Различия между группами оценивали по критерию Манна-Уитни (Mann-Whitney, U-test) и считали статистически значимыми при p < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При микроскопическом исследовании СА1 дорсального отдела гиппокампа у 12-месячных крыс нейроны пирамидного слоя характеризовались округлой формой перикариона с центрально расположенным ядром, как правило, с хорошо выраженным ядрышком. В цитоплазме отмечалось равномерное распределение пылевидной и мелкоглобулярной субстанции Ниссля. Большая часть нейронов характеризовалась нормохромной цитоплазмой перикариона. Признаки гиперхроматоза обнаруживались в небольшом количестве нейронов. Удельное количество сморщенных нейронов с гиперхроматозом цитоплазмы у 12-месячных животных составило 3,9 [1, 7; 10, 9] %. У 24-месячных крыс, по сравнению с 12-месячными животными отмечалось увеличение количества сморщенных нейронов с гиперхроматозом цитоплазмы до 7,1 [3, 7; 15, 0] % (р < 0,05) (рис. 1). *p < 0,05 и ***p < 0,001 - различия между группами статистически значимы (критерий Манна-Уитни). Рис. 1. Динамика изменения удельного количества сморщенных нейронов пирамидного слоя с гиперхроматозом цитоплазмы в СА1 и СА3 дорсального гиппокампа 12- и 24-месячных крыс В СА3 нейроны пирамидного слоя располагались более рыхло, имели полигональную форму с четко визуализируемым везикулярным ядром и одним ядрышком. При этом у старых (24-месячных) крыс многие нейроны характеризовались уменьшением размеров и извитой формой перикарионов, с выраженной базофилией цитоплазмы. Удельное количество сморщенных нейронов с гиперхроматозом цитоплазмы составило 10,0 [6, 8; 14, 0] % у 12-месячных крыс и 29,6 [17, 0; 41, 5] % - у 24-месячных животных (р < 0,001) (рис. 1). В пирамидном слое наблюдался перицеллюлярный отек, в отдельных нейронах-явления вакуолизации цитоплазмы перикариона. Отмечалось уменьшение относительной 14 Выпуск 3 (59). 2016 плотности нейронов, что свидетельствует об убыли нейронов пирамидного слоя [1]. В СА3 нейроны пирамидного слоя располагались более рыхло, имели полигональную форму с четко визуализируемым везикулярным ядром и одним ядрышком. При этом у старых (24-месячных) крыс многие нейроны характеризовались уменьшением размеров и извитой формой перикарионов, с выраженной базофилией цитоплазмы. Удельное количество сморщенных нейронов с гиперхроматозом цитоплазмы составило 10,0 [6, 8; 14, 0] % у 12-месячных крыс и 29,6 [17, 0; 41, 5] % - у 24-месячных животных (р < 0,001) (рис. 1). В пирамидном слое наблюдался перицеллюлярный отек, в отдельных нейронах-явления вакуолизации цитоплазмы перикариона. Отмечалось уменьшение относительной плотности нейронов, что свидетельствует об убыли нейронов пирамидного слоя [1]. При иммуногистохимическом исследовании дорсального отдела гиппокампа 12-месячных крыс с использованием антител против СР в СА1 отмечается умеренно выраженная цитоплазматическая экспрессия иммунопозитивного материала (ИПМ) (2 балла) в нейронах пирамидного слоя и в дендритах радиального слоя. У старых животных (24 месяца) наблюдалась слабо выраженная экспрессия ИПМ (1 балл) лишь в единичных дендритах радиального слоя при сохранении умеренно выраженной цитоплазматической экспрессии ИПМ (2 балла) в перикарионах нейронов пирамидного слоя (рис. 2). Статистически значимых изменений удельного количества иммунопозитивных нейронов пирамидного слоя СА1 у 12- и 24-месячных крыс не обнаружено (р > 0,05). Отмечается изменение преимущественной локализации ИПМ в СА1 при старении: снижение уровня экспрессии ИПМ у 24-месячных крыс в дендритах радиального слоя и увеличение - в перикарионах нейронов пирамидного слоя. При этом суммарно в дендритах и перикарионах нейронов при компьютерном морфометрическом анализе наблюдается лишь тенденция к снижению относительной площади ИПМ (р > 0,05). При оценке результатов иммуногистохимического исследования у 12-месячных крыс в СА3 дорсального отдела гиппокампа отмечается умеренно выраженная цитоплазматическая экспрессия ИПМ (2 балла) в пери-карионах нейронов пирамидного слоя и в дендритах радиального слоя, окружающий нейропиль, характеризуется слабо выраженным окрашиванием (1 балл). При этом у 24-месячных крыс ИПМ локализован преимущественно в перикарионах нейронов пирамидного слоя (2 балла), однако, наряду с иммунопозитивными нейронами (2 балла), встречаются нейроны с иммуннонегативной реакцией, которые характеризуются сморщиванием перикарионов, базофилией цитоплазмы и наличием гиперхромных ядер овальной формы. Экспрессия ИПМ в радиальном слое СА3 носила умеренно выраженный характер (2 балла) в дендритах и слабо выраженный характер (1 балл) в окружающем нейропиле радиального слоя (рис. 3). Статистически значимых различий исследуемых параметров обнаружено не было. Обнаруженные нами признаки структурных повреждений в нейронах пирамидного слоя СА1 и СА3 дорсального отдела гиппокампа у 24-месячных крыс могут быть связаны как с эксайтотоксическим действием высокой концентрации глутамата с вовлечением эк-страсинаптических NMDA-рецепторов GluN2B и активацией сигнальных нейрональных комплексов смерти (NDC) [10], так и с нарушениями кровообращения в сосудах микроциркуляторного русла гиппокампа [2], что рассматривается нами как результат ишемии, снижения нейротрофных и нейропротекторных факторов эндотелия сосудов. Полученные нами данные свидетельствуют о воз-растзависимом снижении уровня экспрессии сериновой рацемазы в дендритах радиального слоя СА1 и СА3 дорсального отдела гиппокампа, что может быть связано с увеличением содержания NO в гиппокампе при старении [2], поскольку D-серин, выделяемый астроцитами, индуцирует быстрое увеличение содержания NO в постсинаптических нейронах, а NO угнетает активность сериновой рацемазы [5]. Рис. 2. Гистологическое строение СА1 вентрального отдела гиппокампа крысы в возрасте 12 месяцев (А) и крысы в возрасте 24 месяцев (Б). Иммуногистохимическое исследование, антитела против сериновой рацемазы, докраска гематоксилином. Ув. х 400 Выпуск 3 (59). 2016 15 ЩШґорСз Рис. 3. Гистологическое строение СА3 дорсального отдела гиппокампа крыс в возрасте 12 месяцев (А) и крыс в возрасте 24 месяцев (Б). Иммуногистохимическое исследование, антитела против сериновой рацемазы, докраска гематоксилином. Ув. х 400 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, в процессе старения у 24-месячных крыс по сравнению с 12-месячными животными, наряду с атрофическими изменениями, обнаруживается увеличение количества поврежденных нейронов, преимущественно, в пирамидном слое СА3 дорсального отдела гиппокампа, что сопровождается возраст-зависимым снижением уровня экспрессии сериновой рацемазы в дендритах st. radialis СА1 и СА3 и рассматривается как признак снижения NMDA-R зависимой синаптической пластичности в гиппокампе. ЛИТЕРАТУРА

Об авторах

А. В. Смирнов

Волгоградский государственный медицинский университет; Волгоградский медицинский научный центр

кафедра патологической анатомии, кафедра фармакологии и биофармации ФУВ

Н. В. Григорьева

Волгоградский государственный медицинский университет

кафедра патологической анатомии, кафедра фармакологии и биофармации ФУВ

Мария Рафаэлевна Экова

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: maria.ekova@mail.ru
аспирант кафедры патологической анатомии

М. В. Шмидт

Волгоградский государственный медицинский университет

кафедра патологической анатомии, кафедра фармакологии и биофармации ФУВ

Д. С. Медников

Волгоградский государственный медицинский университет

кафедра патологической анатомии, кафедра фармакологии и биофармации ФУВ

И. Н. Тюренков

Волгоградский государственный медицинский университет

кафедра патологической анатомии, кафедра фармакологии и биофармации ФУВ

Д. В. Куркин

Волгоградский государственный медицинский университет

кафедра патологической анатомии, кафедра фармакологии и биофармации ФУВ

Е. В. Волотова

Волгоградский государственный медицинский университет

кафедра патологической анатомии, кафедра фармакологии и биофармации ФУВ

Список литературы

Дополнительные файлы