МОДЕЛИРОВАНИЕ САХАРНОГО ДИАБЕТА ТИПА 2 У КРЫС НА ВЫСОКОЖИРОВОЙ ДИЕТЕ С ИНДУКЦИЕЙ СТРЕПТОЗОТОЦИНОМ

Аннотация

Сахарный диабет типа 2 (СД2) является гетерогенным заболеванием со сложным патогенезом, которое связано с генетической предрасположенностью и образом жизни, особенно его диетическим компонентом. Создание экспериментальной животной модели СД2 необходимо для понимания его патогенеза и разработки новых методов лечения.

Полный текст

Type 2 diabetes, streptozotocin, high-fat diet. Сахарный диабет типа 2 (СД2) является гетерогенным заболеванием со сложным патогенезом, которое связано с генетической предрасположенностью и образом жизни, особенно его диетическим компонентом [1]. Существует несколько широко используемых животных моделей СД2. Спонтанные, такие как модели ZuckerDiabeticFatty (ZDF) крыс [2] и Goto-Kakizaki (GK) крыс [3], акцентированы на факторе генетической предрасположенности. Индуцированные модели, как правило, используют относительно высокие дозы стреп-тозотоцина (STZ) (более 50 мг/кг) [4], что ведет к уменьшению синтеза и секреции инсулина в ß-клетках и развитию патологической картины диабета типа1, даже в комбинации 50 мг/кг STZ и высокожировой диеты [5]. Эти модели отличаются от типичного СД2 во многих отношениях, включая патогенез и клинические симптомы. В большинстве случаев СД2, нарушение липидного обмена и периферическая резистентность к инсулину предшествует развитию гипергликемии [6]. По этой причине в литературе описан ряд методов моделирования СД2, сочетающих высокожировую диету с инъекцией низких доз STZ [7, 8]. В работе Yu и соавт. [9] показано, что высокие концентрации жирных кислот в плазме приводят к увеличению внутриклеточной концентрации ацил-КоА и диацилглицерола, приводя к активации PKC-9 и фос-форилированию Ser307 IRS-1. Эти изменения тормозят активацию IRS-1-ассоциированной PI3-киназы, подавляя стимулируемый инсулином захват глюкозы. В свою очередь, гипергликемия и оксидативный стресс исто щают пул инсулина в ß-клетках поджелудочной железы и индуцируют их гибель, замыкая порочный круг патогенеза. Сокращение функциональной массы ß-кле-ток до 50-75 % манифестирует развитие СД2 [10]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Разработка доступной животной патологической модели, воспроизводящей ключевые компоненты метаболического синдрома, включая липотоксичность, глюкозотоксичность и периферическую инсулинорези-стентность, и пригодную для фармакологического скрининга веществ, обладающих антидиабетическим потенциалом. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ В ходе работы были использован стрептозотоцин (STZ, Sigma #S0130, США), 0.1 М цитратный буфер (pH 4.5). Животные. Взрослых самцов крыс Wistar содержали в стандартных клетках по 4 особи при температуре 25 °С и стандартном световом режиме. До начала эксперимента предоставляли свободный доступ к комбикорму и воде. Высокожировая диета. Комбикорм для крыс экструдированный (13000 кДж/кг; белок 19 %, жиры 5 %, клетчатка 4 %, лизин 1,2 %, метионин + цистеин 0,7 %, кальций 0,6-0,9 %, фосфор 0,6-0,9 %, натрий 0,20- 0,25 %), жир свиной, казеин, метионин, витаминно-минеральный премикс «Ушастик» (Россия). В 1 кг пре-микса содержится витамина А - 1000000 МЕ, витамина D3 - 300000 МЕ, витамина Е - 1,0 г, витамина В2 - 30 Выпуск 1 (61). 2017 0,6 г, витамина В12 - 12 мг, железо - 20 г, медь - 4 г, марганец-6 г, цинк - 10 г, кобальт-0,08 г, йод - 0,4 г Компоненты отвесить в соответствии с таблицей 1 из расчета 30 г смеси на 1 животное в сутки, измельчить и смешать до однородности. Хранить при +4 °С. Таблица 1 Состав высокожировой диеты Компонент Масса, г/кг Комбикорм 370 Жир свиной 313 Казеин 253 Витаминно-минеральная смесь 61 Метионин 3 Развитие патологии. Крысы были разделены на 2 группы. Опытная группа (12 особей) получала высокожировую диету (58 % жиров, 25 % белка, 17 % углеводов от общего количества калорий), контрольная группа (10 особей) получала нормальную диету в том же количестве при свободном доступе к воде. Через 1 неделю регистрировали вес животных и уровень глюкозы крови. Через 2 недели животным опытной группы ввели 35 мг/кг стрептозотоцина в цитратном буфере внутри-брюшинно, животным контрольной группы - 1 мл/кг цитратного буфера внутрибрюшинно. Через 3 недели регистрировали вес животных и уровень глюкозы крови повторно. Интраперитонеальный тест толерантности к глюкозе и инсулину. Были отобраны по 4 животных из опытной и контрольной групп. За 3 часа до начала экспери мента они были лишены еды с сохранением свободного доступа к воде. Всем животным были введены 1 мг/кг глюкозы и 0,175 МЕ/кг инсулина в изотоническом растворе натрия хлорида интраперитонеально. Образцы крови забирали из хвостовой вены перед инъекцией, на 5-й, 10-й, 15-й и 30-й минутах. Анализ образцов крови. Кровь отбирали из хвостовой вены мерным капилляром типа «end-to-end» объемом 20 мкл и гемолизировали в 1 мл раствора глюкоза/ лактат гемолизирующего. Уровень глюкозы в плазме крови определяли с помощью биохимического анализатора BiosenCJ_ine (EKF Diagnostics, Германия). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Вес и уровень глюкозы крови животных контрольной группы оставался стабильным на протяжении всего эксперимента. Для животных опытной группы после инъекции STZ отмечен существенный рост уровня глюкозы плазмы крови; смертность в течение первых 4 суток составила 33 %. В последующие дни показатели массы тела оставались стабильными в обеих группах, гибели животных не отмечено (табл. 2). Через 3 недели от начала эксперимента отмечено статистически значимое увеличение уровня инсулина, глюкозы, три-глицеридов и холестерина крови животных (рис. 1). С целью определения инсулинорезистентности обеих групп животных был проведен интраперитонеальный тест толерантности к глюкозе и инсулину. Показано, что уровень глюкозы крови крыс опытной группы статистически превышал уровень глюкозы контрольной группы во всех Таблица 2 Эффект высокожировой диеты и стрептозотоцина на массу и уровень глюкозы крови животных Показатель До введ ения STZ Через 7 дней после введения STZ Контроль HFD Контроль HFD+STZ Вес, г 353,8 ± 8,3 426,3 ± 13,3 353,6 ± 8,0 381,5 ± 17,5 Глюкоза крови, мМ 5,89 ± 0,12 5,64 ± 0,12 3,95 ± 0,12 13,06 ± 1,10 *HFD - высокожировая диета. 15-, .Û с=І О X ш о о. СО ОС со о. о 10- 5- Контроль HFD+STZ і Контроль HFD+STZ Глюкоза Триглицериды Холестерин Рис. 1. Эффект 3-недельной высокожировой диеты и введения 35 мг/кг стрептозотоцина на биохимические параметры крови крыс Выпуск 1 (61). 2017 31 ІШторСз временных точках (p < 0,0001). Также для опытной группы уровень глюкозы на всем протяжении теста статистически значимо превышал базальный уровень до начала теста (p=0,032), в то время как для контрольной группы таких отличий не наблюдалось (рис. 2). Контроль HFD+STZ Рис. 2. Интраперитонеальный тест толерантности к глюкозе и инсулину для группы контроля и группы, получавшей высокожировую диету, спустя 7 дней после введения 35 мг/кг STZ. Средние значения ± SEM, n = 4. Все данные статистически значимы по отношению к контролю (p < 0,0001) ЗАКЛЮЧЕНИЕ Сочетание 3-недельной высокожировой диеты с последующим введением 35 мг/кг стрептозотоци-на внутрибрюшинно привело к развитию выраженной гипергликемии и повышению толерантности к инсулину и глюкозе у крыс Wistar. Необходимо отметить, что выявленная выраженность нарушения утилизации глюкозы уступает описанной авторами аналогичных методик.