PERSISTENCE OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS IN THE UTERINE CERVIX AND ALLELIC GENE POLYMORPHISM OF TOLL-LIKE RECEPTORS AND INTERFERON LAMBDA

Full Text

Human papillomavirus, polymorphism, Toll-like receptor, Pap smear. 56 Выпуск 3 (63). 2017 Современные подходы к проблеме повышения качества лечения все больше и больше связаны с развитием принципов персонифицированной медицины. Это подходы к лечению патологического процесса у конкретного человека с учетом уникальных особенностей его генома. Концептуальную основу предикативной медицины составляют представления о генетическом полиморфизме. За генетическую предрасположенность чаще всего отвечают однонуклеотидные замены (SNP) [7]. В настоящее время общепризнано, что восприимчивость к инфекционным заболеваниям генетически детерминирована и, по-видимому, большое значение имеют гены иммунного ответа и воспаления. С ответом на инфекцию и манифестацией заболевания может быть ассоциирован функциональный полиморфизм генов, кодирующих рецепторы врожденного иммунитета, кото рые играют ключевую роль в предрасположенности и тяжести инфекционного процесса [11]. Cреди заболеваний, передающихся половым путем, особое значение имеет папилломавирусная инфекция (ПВИ), обладающая онкогенным потенциалом. Учитывая тропность вируса папилломы человека (ВПЧ) к многослойному плоскому эпителию, большое значение принадлежит системе местной защиты органов репродуктивного тракта. Ткани шейки матки обладают автономной иммунной системой, функционирующей за счет гуморальных и клеточных факторов [3]. На ранней стадии инфекции взаимосвязанными процессами микробного распознавания, клиренса, воспаления и клеточной смерти управляет система врожденного иммунитета, которая представлена нейтрофи-лами, моноцитами/макрофагами и дендритными клетками, распознающими патогенмолекулярные паттерны благодаря специализированным паттерн-распознающим рецепторам (ПРР). Одним из наиболее важных представителей семейства ПРР являются Toll-подобные рецепторы (TLR) [2]. TLR являются предметом активного изучения, как в норме, так и при различных патологиях [1]. В последние годы ведутся работы по поиску ассоциаций аллельных полиморфизмов в генах TLR с патологическими состояниями на уровне слизистых оболочек, в том числе при заболеваниях урогенитального тракта [4]. Общепринятым методом диагностики патологии шейки матки является цитологическое исследование мазков с шейки матки и цервикального канала, с целью оценки клеточного состава и обнаружения атипичных клеток. Цитологическое исследование в настоящее время является одним из экономически выгодных методов. Кроме этого, учитывая, что РШМ является ВПЧ-ассоциированным заболеванием, значительное место в диагностике ПВИ занимают молекулярно-биологические методы [5]. У каждого метода имеется определенная специфичность и чувствительность, что может ограничивать их использование. Предпринимаются попытки комбинировать методы, что повышает диагностическую эффективность, однако увеличивает стоимость обследования. Внедрение новых технологий открывает новые возможности для профилактики РШМ, что является основой для снижения частоты этого заболевания в целом и открывает новые перспективы в сохранении здоровья женщины. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Оценка генетически детерминированных иммунологических аспектов патогенеза папилломавирусной инфекции на основе комплексной оценки генетических и цитологических параметров, и выявлении предикторов эффективного противоинфекционного иммунитета. Задачи 1. Оценить состояние цитологических мазков с шейки матки у исследуемых женщин с целью оценки клеточного состава и выявления наличия атипичных клеток. 2. Оценить распределение вариантов полиморфных локусов (A2848G), (Т-1237С) TLR 9, (Phe412 Leu) TLR 3 и (rs8099917 T > G) IL28B в исследуемых группах женщин. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ В ходе работы было проведено обследование 194 женщин в возрасте 18-49 лет, из анамнеза которых известно наличие ВПЧ высокого онкогенного типа (ВОТ). Материалом для лабораторного исследования являлись соскоб со слизистой оболочки шейки матки и периферическая кровь пациенток, взятая утром натощак, в пробирки с антикоагулянтом 3 % ЭДТА. Все обследуемые наблюдались на протяжении не менее трех лет. Определение ДНК ВПЧ 16 и 18 типов проводили методом ПЦР по конечной точке (наборы реагентов «АмплиСенс ВПЧ 16/18-FL», производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, ООО «ИнтерЛабСервис», Москва) в сочетании с цитологическим исследованием мазков из шейки матки (окраска по Паппенгейму). Оценка результатов цитологического исследования производилась согласно классификации Бетесда. В зависимости от присутствия вируса женщины были разделены на две группы: 98 пациенток с персистирующей паппиломави-русной инфекцией (первая группа ВПЧ +) и 96 женщин без ВПЧ (вторая группа ВПЧ-). Для исследования точечных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) генов TLR и IL-28B использовались образцы ДНК, выделенной из лейкоцитов крови. Идентификация полиморфных аллелей генов осуществлялась методом аллельспецифической полимеразной цепной реакции с последующей электрофоретической детекцией в агарозном геле. На всех стадиях проведения молекулярно-генетических исследований использовались реактивы и методики, разработанные ООО НПФ «Литех» (г. Москва). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Проведенный анализ анамнестических данных обследованных пациенток показал, что возраст женщин в обследуемых группах колебался от 18 до 49 лет. Большинство женщин (55,3 %) находились в возрастной группе 18 до 30 лет, что подтверждает многочисленные данные международных и отечественных исследований о том, что у женщин молодого возраста ВПЧ-ассо-циированная патология встречается чаще, однако и в зрелом возрасте является проблемой. По результатам цитологического исследования плоскоклеточные интра-эпителиальные поражения были выявлены у 21 пациентки (21 %) с персистирующей ПВИ, что значимо больше, чем в группе женщин без ВПЧ (9 женщин - 9 %). Дистрофические изменения, отражающие воспалительный процесс, встречались чаще в группе женщин с персистенцией ВПЧ - у 95 пациенток (98 %) по сравнению с группой женщин без ВПЧ - у 87 женщин (91 %), p = 0,03. Только у 2 (2 %) пациенток из группы ВПЧ+ мазки соответствовали норме, что значимо меньше по сравнению с 9 (9 %) женщинами из группы ВПЧ-. Таким образом, у пациенток с персистентной формой ПВИ цитологические мазки чаще носили патологический характер, что свидетельствует о сопряженности хронической инфекции ВПЧ с другими негативными процессами в слизистой оболочке шейки матки. В литературе имеются многочисленные и в то же время противоречивые данные о роли TLR 9 в развитии рака шейки матки при ВПЧ. В ряде исследований установлено, что у пациенток с персистирующей ПВИ не выявлялись клетки, продуцирующие TLR 9 [6, 9, 13], другие исследования показали активную экспрессию TLR 9 раковыми клетками [8]. Существует достаточно работ, посвященных оценке роли полиморфных вариантов гена TLR 9, в развитии риска цервикальных Выпуск 3 (63). 2017 57 ІШторСз [ЩсміПГКЩ неоплазий при ВПЧ [14, 15]. Таким образом, можно предположить, что конкретные snp TLR 9 могут влиять и на клиренс вируса. Результаты исследования распределения SNP мутаций А2848G TLR 9 среди пациенток исследованных групп позволили установить, что у женщин с пер-систенцией ВПЧ частота встречаемости гомозиготы АА была 22 %, что значимо больше, чем в группе женщин без ВПЧ (11 %). В то же время гетерозиготный фенотип AG у пациенток с персистирующей паппиломавирус-ной инфекцией встречался реже, чем у женщин без ВПЧ (37 % и 56 % соответственно). В то же время другой исследуемый полиморфизм TLR 9, Т-1237С не был связан с персистенцией ВПЧ. Так, при сравнении пациенток с персистирующей паппиломавирусной инфекцией и женщин без ВПЧ не было выявлено значимых различий в распределении вариантов этого полиморфизма. TLR3 является одним из основных медиаторов противовирусного иммунного ответа, поскольку распознает вирусную РНК в цитоплазме зараженных клеток. Однако данные относительно роли TLR 3 и персистен-цией ПВИ и ее исходов не однозначны. Так, одни исследователи обнаружили связь между клиренсом ВПЧ и уровнем экспрессии TLR 3 [9], другие установили, что повышенный уровень TLR 3 может быть маркером уже диспластических изменениях эпителия [10]. Установлено, что SNP-полиморфизм Phe-412 Leu TLR3 сопряжен с изменением структуры белка и концентрации или активности продукта гена. В нашем исследовании анализ частоты встречаемости аллельных вариантов полиморфного локуса Phe412 Leu гена TLR 3 позволил установить значимо меньшую частоту встречаемости гомозиготного генотипа Phe/Phe у пациенток с персистенцией ВПЧ по сравнению с группой женщин без ВПЧ (4 % против 13 %). В то же время гомозиготный фенотип Leu/Leu у пациенток с персистирующей паппиломавирусной инфекцией встречался чаще, чем у женщин без ВПЧ (55 % и 42 % соответственно). В настоящее время точно установлено, что изменения в кластере генов цитокинов (IL28A, IL28B и IL29 -так называемые INF-Х) являются важным фактором, определяющим особенности противовирусной защиты организма. INF-Х индуцирует противовирусные, антипро-лиферативные, противоопухолевые и иммунные эффекты. Наибольшее значение имеет полиморфизм в регионе, примыкающем к гену интерлейкина 28B (IL28B) [12]. Установлено, что он ассоциирован с генетической резистентностью к вирусным инфекциям и эффективностью лечения хронического гепатита С комбинированной противовирусной терапией и помогает прогнозировать вероятность самопроизвольной элиминации вируса. В нашем исследовании, при сравнении пациенток с персистирующей паппиломавирусной инфекцией и женщин без ВПЧ не было выявлено значимых различий в распределении вариантов полиморфизма rs8099917 T>G гена IL28B. Это может свидетельство вать о незначительной роли INF-Х в местном иммунитете против ВПЧ. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные нами данные позволяют сделать следующие выводы: 1. Женщины с высокоонкогенными типами ВПЧ 16 и 18 типов являются группой риска по развитию цервикальных интраэпителиальных поражений. У пациенток с персистентной формой ПВИ цитологические мазки чаще носили патологический характер. 2. Toll-рецепторы принимают активное участвуют в элиминации ВПЧ из организма, наличие определенных полиморфных локусов гена TLR9 (A2848G) и TLR3 (Phe-412 Leu) предрасполагает к хронизации процесса. 3. Изученный полиморфный вариант rs8099917 T > G гена INF-Х не связан с персистенцией вируса папилломы человека. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

T. S. Kiseleva

Mikhailivsky Central District Hospital

Email: sveklashka@rambler.ru

O. P. Gumilevskaya

Military Medical Academy named after S. M. Kirov

U. B. Matohina

Volgograd State Medical University

K. P. Vakhaniya

Volgograd State Medical University

References

Supplementary files