СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АГГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИММУННЫХ СЫВОРОТОК В ОТНОШЕНИИ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МЕЛИОИДОЗА И САПА, ВЫДЕЛЕННЫХ В РАЗЛИЧНЫХ РЕГИОНАХ

Полный текст

Agglutination, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei. Возбудители мелиоидоза (Burkholderia pseudo- Сап (возбудитель B. mallei) - зоонозная антропоmalle/) и сапа (Burkholderia mallei) относятся к микро- ургическая инфекция, регистрируемая в Монголии, Турорганизмам II группы патогенности (опасности). Ука- ции, Иране, Ираке, странах Аравийского полуострова, занные микроорганизмы являются потенциальными Китае, Индии, Индонезии, Филиппинах [14]. Случаи заагентами биотерроризма группы В [7], и не исключена ражения человека связаны с профессиональной деятельвозможность преднамеренного их использования в ка- ностью: ветеринары, работники мясоперерабатывающих честве биологического оружия [4, 8, 14]. Их роль в предприятий, сотрудники лабораторий, дрессировщики инфекционной заболеваемости человека и некоторых лошадей. B. pseudomallei (возбудитель мелиоидоза) животных рассматривается в связи с существовани- входит в состав микробиоты почвы и воды стоячих воем эндемичных регионов и появлением завозных слу- доемов. К странам, где распространен возбудитель мечаев инфекций. лиоидоза, относятся Индия, Шри-Ланка, Филиппины, 44 Выпуск 1 (65). 2018 Индонезия, Таиланд, Сингапур, Вьетнам, Малайзия, Бирма, Бразилия, Пуэрто-Рико, острова Карибского бассейна, Африка и Австралия. В США, Тихоокеанском регионе, Европейских странах были зарегистрированы спорадические случаи этого заболевания у людей, прибывших с эндемичных территорий [5]. Наибольшее число заболеваний за период 2000-2016 гг. отмечено в Таиланде и Северной Австралии. Согласно опубликованным в 2016 г результатам прогнозно-аналитических исследований специалистов Oxford, Cambridge (Великобритания), Mahidol (Таиланд), Fortaleza (Бразилия), Департамента пандемических и эпидемических заболеваний ВОЗ (Швейцария) и других исследователей, современная заболеваемость мелиоидозом в мире может быть оценена на уровне 165 000 случаев в год, а уровень смертности - около 80 000 ежегодно [10]. Отсутствие характерной симптоматологической картины, затрудняющей клиническую диагностику, высокая смертность среди больных острыми формами (пневмонией, септицемией), а также длительная, далеко не всегда эффективная антибактериальная терапия при хроническом течении инфекции являются основными причинами, требующими по отношению к мелиоидозу пристального внимания специалистов учреждений здравоохранения и санитарно-эпидемиологических служб. В практической работе для ускоренного выявления и последующей идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза используют молекулярно-генетические методы (масс-спектрометрия, ПЦР-анализ) и иммуно-диагностические тесты с использованием моноклональных антител (МКА) [9, 13]. Метод ориентировочной реакции агглютинации на стекле наиболее прост, не требует дополнительного оборудования и может быть достаточно легко выполнен. Антигенный состав штаммов В. pseudomallei и B. mallei неоднороден, зависит, как правило, от географической принадлежности штаммов и обуславливает результаты агглютинации различными сыворотками. В литературе описаны случаи, когда отдельные штаммы В. pseudomallei не были идентифицированы посредством этого метода. Так, изолят, выделенный от больного хроническим мелиоидозом в Дарвине (Австралия), не агглютинировался мелиоидозной сывороткой. Диагноз мелиоидоз был поставлен данному пациенту еще в 1989 году и в настоящее время он является единственным живым человеком с таким хроническим заболеванием, периодически рецидивирующем на протяжении 25 лет Сравнительная характеристика геномов штаммов, выделенных в начале, на протяжении всего времени болезни, и в 2014 году, выявила различия в экспрессии многих генов, участвующих в патогенезе. Особый интерес представляла утрата экспрессии гена wcbR, кодирующего синтазу жирных кислот, необходимую для синтеза капсулярного полисахарида. По мнению авторов, именно данный факт объясняет отрицательные результаты агглютинации выделенного изолята [6]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Выявление наиболее эффективной экспериментальной сыворотки для предварительной идентификации патогенных буркхольдерий в РА. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Для работы использовали штаммы возбудителей сапа и мелиоидоза: B. mallei - 9, B. pseudomallei -37 штаммов, мутантный авирулентный штамм B. pseudomallei VPA коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора. Культивирование микроорганизмов проводили на Nutrient-агаре, рН 6,8, при 37 °С в течение 48 ч. Использовали четыре вида экспериментальной кроличьей иммунной сыворотки: к живым клеткам ави-рулентного штамма B. pseudomalei VPA, к инактивированным кипячением клеткам штамма B. pseudomalei С-141, к экстрацеллюлярным антигенам (ЭЦА) B. thailandensis 264 и комплексная сыворотка к клеткам штаммов B. thailandensis251, 264, 265, 295 и 299, полученных сотрудниками лаборатории сапа и мелиоидоза [1, 2]. Реакцию агглютинации (РА) проводили объемным методом. Из сыворотки готовили двукратные последовательные разведения от 1:20 до 1:1280, в которые в равном объеме добавляли антиген (Аг) в виде бактериальной суспензии в 0,15 М NaCl pH 7,2 ± 0,2 в конечной концентрации 5 х 102 м.к./мл (кроме контроля). Пробирки встряхивали и оставляли на 2 часа при температуре (37 ± 0,1) °С, затем учитывали предварительный результат реакции. Окончательный результат реакции агглютинации регистрировали через 18-20 часов инкубации при комнатной температуре. При учете результатов реакции агглютинации степень разведения сыворотки, при которой реакцию считали положительной, расценивали как низкую (1:101:40), среднюю (1:80-1:320) и высокую (1:640-1:2560). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Поскольку стандартные (производственные) диагностические видоспецифические сыворотки ни для одного вида буркхольдерий не выпускаются, в условиях специализированных лабораторий для постановки диагностических иммунологических реакций используют экспериментальные серии препаратов. Для получения иммунных сывороток от лабораторных животных в работе чаще всего используют либо живые клетки авирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза и сапа и штаммов филогенетически родственных непатогенных видов, либо антигенные комплексы B. pseudomallei и B. mallei. Ранее сотрудниками ФКУЗ Волгоградский научноисследовательский противочумный институт Роспотребнадзора был получен авирулентный пуринзависимый штамм B. pseudomallei VPA, селекционированный из Выпуск 1 (65). 2018 45 Шєтрій ©шгГІМЩ штамма B. pseudomallei С-141 с помощью химического мутагенеза. В литературе отмечено, что с приобретением ауксотрофности по аденину (пуриновой зависимости) штаммы B. pseudomallei становились авиру-лентными для мышей линии BALB даже при интрана-зальном заражении в высоких дозах [11, 12]. В настоящей работе мы исследовали четыре вида экспериментальной кроличьей иммунной сыворотки, полученной к живым клеткам авирулентно-го штамма B. pseudomallei VPA, к инактивированным клеткам референтного штамма B. pseudomallei С-141 и к клеткам близкородственного условно патогенного вида B. thailandensis (к ЭЦА и к живым клеткам комплекса из 5 штаммов B. thailandensis 251, 264, 265,295 и 299). В результате, исследуемые коллекционные штаммы возбудителей сапа и мелиоидоза агглютинировались всеми используемыми экспериментальными сыворотками в различных разведениях (рис. 1). 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 Разведение сыворотки • к клеткам B. pseudomallei VPA ♦ к Аг B.pseudomalei С-141 " Д " к клеткам B.thailandensis 251, 264, 265,295, 299 ™Х ■ к ЭЦА B.thailandensis 264 Рис. 1. Показатели агглютинации штаммов B. pseudomallei и B. mallei экспериментальными сыворотками Наиболее активной оказалась сыворотка, полученная против живых клеток авирулентного мутанта B. pseudomallei VPA, в развернутой реакции агглютинации с живыми микробными клетками (м.к.) возбудителя мелиоидоза, менее активна была сыворотка против инактивированных клеток вирулентного референтного штамма B. pseudomallei С-141, а с сыворотками против B. thailandensis агглютинация наблюдалась только в низких разведениях. При исследовании штаммов возбудителя мелиоидоза, три штамма B. pseudomallei VPA, 57576, 60839 агглютинировались всеми использованными сыворотками в высоких разведениях (1:1280), шесть штаммов B. pseudomallei ВКМ-900, 57582, 611083, 109, 56738, 60806 - в низких разведениях (1:20-1:40) (рис. 2). Перечисленные штаммы характеризовались высоким уровнем вирулентности для золотистых хомячков (LD 50 1-10 м.к., за исключением авирулентного мутанта B. pseudomallei VPA) и были выделены во Вьетнаме (за исключением B. pseudomallei 109 - в Австралии). Вместе с тем, в более раннем аналогичном исследовании было установлено, что некоторые коллекционные штаммы возбудителя мелиоидоза австралийского происхождения отличались низкой способностью к агглютинации. Особенно выделялись два штамма -B. pseudomallei 111 и 114, у которых было выявлено отсутствие Аг6, одного из основных антигенных комплексов возбудителя мелиоидоза [3]. VPA, 57576, 60839 • к Аг B.pseudomalei С-141 ■ к клеткам B. pseudomallei VPA " к ЭЦА B.thailandensis 264 - - -к клеткам B.thailandensis 251, 264, 265,295, 299 Рис. 2. Агглютинация клеток коллекционных штаммов B. pseudomallei экспериментальными сыворотками (по радиальной шкале - значения различного титра сывороток: от 1:20 до 1:1280) В результате изучения штаммов возбудителя сапа четыре штамма B. mallei5584, B-120, 10230, Muksuwar агглютинировались всеми использованными сыворотками в средних и высоких разведениях (1:160-1:1280), три штамма B.mallei Будапешт, Z-12, 11 - в низких разведениях (1:10-1:40) (рис. 3). 10230 Рис. 3. Агглютинация клеток коллекционных штаммов B. mallei экспериментальными сыворотками (по радиальной шкале - значения различного титра сывороток: от 1:20 до 1:1280) Стоит отметить, что основная масса штаммов патогенных буркхольдерий (83 %) агглютинировалась в РА сывороткой, полученной против живых м.к. B. pseudomallei VPA в высоких разведениях, менее 46 Выпуск 1 (65). 2018 активна была сыворотка против инактивированных клеток B. pseudomallei С-141, с комплексной сывороткой против B. thailandensis и с ЭЦА B. thailandensis 264 агглютинация наблюдалась только в низких разведениях, за исключением отдельных штаммов. Сыворотки против штаммов B. pseudomallei VPA и B. pseudomallei С-141 были получены традиционным способом иммунизации животных, предусматривающего применение в качестве антигена цельные живые клетки или инактивированные взвеси м.к. с широким антигенным спектром. Подобный подход не всегда приводит к получению высокоактивных, а тем более специфичных сывороток. Судя по результатам РА, иммунизация инактивированной взвесью м.к. приводила к формированиюменее активной сыворотки, чем при иммунизации живыми м.к. Это может быть объяснено тем, что из-за процедуры предварительной инактивации клеток B. pseudomallei в организме лабораторных животных формировались антигенные комплексы со сниженной иммуногенностью. При этом взвесь для иммунизации содержала цельные убитые м.к., разрушенные и также определенный процент балластных веществ, что также не способствовало формированию высокоактивной и специфичной сыворотки. Виды B. pseudomallei и B. thailandensis являются фенотипически и генетически близкородственными, с существенной разницей только в вирулентности по отношению к человеку и животным. Потому B. thailandensis часто применяют в различного рода исследованиях как авирулентный аналог возбудителя мелиоидоза. B. pseudomallei и B. mallei имеют очень сходную антигенную структуру, и именно поэтому для предварительной идентификации возбудителя сапа возможно использование иммунной сыворотки, полученной против возбудителя мелиоидоза. Известны как видовые, так и перекрестнореагирую-щие и общие антигены B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis, что объясняет то, что штаммы патогенных буркхольдерий агглютинировались сыворотками, полученными против B. thailandensis, однако только в низких разведениях. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, штаммы возбудителей сапа и мелиоидоза коллекции ФКУЗ Волгоградский научноисследовательский противочумный институт Роспотребнадзора агглютинировались всеми используемыми экспериментальными сыворотками, но в различных разведениях. 8 % штаммов B. pseudomallei и 44 % штаммов B. mallei агглютинировались сыворотками в средних и высоких разведениях (1:160-1:1280); 16 % штаммов B. pseudomallei и 33 % штаммов B.mallei - в низких разведениях (1:10-1:40). Четкой корреляции между характером агглютинации и географической принадлежностью штаммов, а также уровнем их вирулентности выявлено не было. Наиболее эффективной экспериментальной сывороткой для предварительной идентифика ции патогенных буркхольдерий в РА оказалась сыворотка, полученная против живых м.к. авирулентного штамма B. pseudomallei VPA.

Об авторах

Елена Владимировна Молчанова

ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

Email: elenakalinki@yandex.ru
к. м. н., с. н. с. лаборатории коллекционных штаммов

Н. П Агеева

ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

Д. М Фролов

ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

И. Ю Мазурова

ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

Список литературы

Дополнительные файлы