ПАРАДОКСАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ АМИНОГУАНИДИНА В МОДЕЛИ ГЛИКОКСИДАЦИИ В ПРИСУТСТВИИ КАТИОНОВ CU(II)

Полный текст

Конечные продукты гликирования (КПГ) являются важным звеном в патогенезе формирования поздних осложнений сахарного диабета (ПОСД) [3]. Одним из методов в оценке способности соединений влиять на образование КПГ является регистрация флуоресценции [4]. Флуоресцирующие КПГ различаются по характеристикам поглощения и излучения, к ним относятся аргпиримидин (Aex 330 нм, Aem 400 нм), кросслин (Aex 379 нм, Aem 463 нм), пентозидин (Aex 335 нм, A 385 нм), весперлизин А (Aex 366 нм, Aem 442 нм), весперлизин B (Aex 366 нм, Aem 442 нм), весперлизин С (Aex 345 нм, Aem 405 нм) и др. [5]. Аминогуанидин является одним из наиболее изученных соединений с антигликирующей активностью. Из-за побочных эффектов препарата в клинических испытаниях исследования на людях были остановлены. С целью разработки наиболее безопасной антигликирующей композиции поиск новых соединений надлежит дополнять детальным анализом неудачного опыта предшествующих попыток. Интерес представляет активность амино-гуанинидина в реакционных средах гликирования, содержащих катионы переходных металлов. Ранее было показано, что антигликирующее действие аминогуанидина снижается в присутствии катионов Cu(II) [6], сам аминогуанидин приобретает прооксидантные свойства [7]. Ряд фактов остается несогласованным: 1) катионы переходных металлов (в частности, меди) способны ускорять гликирование через усиление оксидативных процессов (гликоксидация) [8, 9]; 2) хелатирование является одним из механизмов действия антигликирующих соединений, способное замедлять образование КПГ [10]; 3) аминогуанидин обладает хелатирующей активностью [10]; 4) несмотря на наличие хелатирующе-го действия, в присутствии катионов меди активность соединения снижается [6]. По этой причине изучение описанных свойств аминогуанидина является важным для понимания прикладных аспектов реакции гликирования как модели разработки новых соединений, а также фундаментальных основ механизма действия аминогуанидина. Ранее нами было показано, что аминогуанидин в среде гликоксидации с катионами меди (II) теряет активность [11]. Оценка интенсивности образования КПГ была дана спектрофлуориметрически, на длинах волн, характерных для весперлизинов А и В (370/440 нм). Известно, что наряду с нефлуоресцирующим карбоксиметиллизином, флуоресцирующий аргпиримидин составляет мажоритарную фракцию среди продуктов гликирования [12]. ijcaeTDpfe ©©rarf ищ* ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучение действия аминогуанидина в среде гликоксидации, с регистрацией изменений аргпиримидина спектрофлуориметрическим методом. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальная процедура Постановка реакции гликирования проведена двумя методами: 1) гликирование бычьего сывороточного альбумина (БСА) (1 мг/мл) глюкозой (0,4 М) в фосфатном буферном растворе (0,05 М) в качестве референтной тест-системы для исследования активности аминогуанидина, на которой активность соединений известна и наиболее часто применяется в исследованиях in vitro [1]; 2) глико-ксидация БСА (1 мг/мл) глюкозой (0,4 М) в присутствии катионов Cu(II) (CuSO4*5H2O, 40 мкМ) как основная методика, активность аминогуанидина в которой подлежит проверке [2]. Активность аминогуанидина оценена в концентрациях 1, 3, 10 мМ. Отобранные концентрации аминогуанидина многократно превосходят достигнутый пик концентрации соединения в плазме (50 мкМ) [13], однако концентрации всех реагентов подобраны с целью максимального усиления регистрируемого признака и исключения возможности потери части данных по причине физиологических (низких) концентраций. HEPES-буферная система в реакции гликокси-дации использована как система, не взаимодействующая с катионами Cu(II), позволяющая им принимать участие в реакции гликирования [14]. Условия реакции в обоих случаях: температура инкубации 60 °С, продолжительность инкубации 24 часа. Прирост аргпиримидина определен спектрофлуориметрически (Aex 330 нм, Aem 360450 нм). В работе использован микропланшетный ридер Tecan Infinite 220 Pro (Австрия), аминогуанидина гидрохлорид (Sigma, США), БСА (Хим-мед, Россия), глюкоза (Вектон, Россия), соли для приготовления буферных растворов - двухосновный фосфат натрия, одноосновный фосфат калия, натрия хлорид, калия хлорид, HEPES (Sigma, США). Дизайн исследования В ходе работы исследовано предположение о связи антигликирующей активности аминогуанидина с присутствием катионов Cu(II). БСА как субстрат гликирования был проинкубирован в комбинациях реагентов, приведенных в табл. 1, что позволяет отразить вклад катионов Cu(II) в активность соединения и зависимость от концентрации аминогуанидина. Таблица 1 Варианты комбинации реагентов при постановке реакции гликирования/гликоксидации Вари ант Cu(II), 40 мкМ HEPES, 0,1 М Фосфатный буфер, 0,05 М Глю коза, 0,4 М Аминогу-анидин (концентрации 1-10 мМ) 1 + + - + + 2 + + - + - 3 + + - - + 4 + + - - - 5 - + - + + 6 - + - + - 7 - + - - + 8 - + - - - 9 - - + + + 10 - - + + - 11 - - + - + 12 - - + - - Во всех случаях в качестве субстрата гликирования использован БСА. Математическая обработка данных Статистическую обработку данных провели с применением однофакторного и трехфакторного дисперсионного анализа (GraphPad Prism 7.0). Определение показателей описательной статистики дано в программе Microsoft Excel 2010. Уровень активности (в случае ее наличия) определен сравнением индексов прироста флуоресценции, установленных по формуле: I _ 1 0(log10(X)-log10(Y)) где Х соответствует значению пробы, содержащей глюкозу, Y соответствует безглюкозному эквиваленту данной пробы. Индексы прироста флуоресценции использованы при определении IC50. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Настоящее исследование является продолжением ранее проводимого испытания, показавшего, что присутствие катионов Cu(II) в реакционной среде способно вызывать прирост флуоресценции в диапазоне длин волн возбуждения/испускания 370/440 нм, характерных для весперлизинов А и В [11]. В результате исследований был получен набор спектрограмм, отражающих уровень флуоресцентной эмиссии реакционных сред на длинах волн, характерных для аргпиримидина. Усредненные спектрограммы представлены на рис. 1. Длина волны эмиссии, нм Длина волны эмиссии, нм Ь г S X г со Длина волны эмиссии, нм ijcaeTDpfe ©©ffiTrf 0Щ>: Л I 3000 “■ 2000в-. AUC=89210,0±2870,6 4° ^ 4? ^ ^ f Длина волны эмиссии, нм М I 3000- S-2000- AUC=47173,3±418,8 с£ Длина волны эмиссии, нм Примечание. AUC - площадь под кривой (M ± SEM). Рис. 1. Уровни эмиссии флуоресценции реакционной среды в различных сочетаниях реагентов при возбуждении реакционной среды электромагнитным излучением в диапазоне 330 нм и испусканием, зарегистрированным в диапазоне 360-450 нм с шагом 10 нм: А - Cu(II), HEPES, глюкоза, БСА; Б - Cu(II), HEPES, БСА; В - Cu(II), HEPES, глюкоза, БСА, аминогуанидин 10 мМ; Г - Cu(lI), HEPES, БСА, аминогуанидин 10 мМ; Д - HEPES, глюкоза, БСА; Е - HEPES, БСА; Ж - HEPES, глюкоза, БСА, аминогуанидин 10 мМ; З - HEPES, БСА, аминогуанидин 10 мМ; И - PBS, глюкоза, БСА; К - PBS, БСА; Л - PBS, глюкоза, БСА, аминогуанидин; М - PBS, БСА, аминогуанидин Представленные на рис. 1 значения площадей под кривыми уровней флуоресценции для графиков «А» - «З», а также значения площадей под кривой для концентраций аминогуанидина 1 и 3 мМ, не представленных на рис. 1, были проанализированы статистически (трехфакторный дисперсионный анализ) с целью установить вклад факторов концентрации аминогуанидина (0, 1, 3 или 10 мМ), присутствия/отсутствия катионов меди (II), присутствия/отсутствия глюкозы в результат. Установлено, что вклад каждого из представленных факторов вносит высокий, статистически значимый вклад (р < 0,0001) в результирующий уровень флуоресценции реакционной среды. Выдача результатов статистического анализа представлена в табл.2. Таблица 2 Результат трехфакторного дисперсионного анализа вклада факторов присутствия/отсутствия глюкозы, катионов меди и различных концентраций амино-гуанидина (1-10 мМ) в уровень флуоресценции, зарегистрированной на длинах волн возбуждения 330 нм и испускания в диапазоне 360-450 нм Фактор/сравнение % от общей дисперсии Уровень р Концентрация аминогуанидина 4,591 < 0,0001 Глюкоза 3,649 < 0,0001 Присутствие/отсутствие катионов СЩИ) 71,29 < 0,0001 Концентрация аминогуанидина * глюкоза 6,628 < 0,0001 Концентрация аминогуанидина * катионы меди(И) 5,229 < 0,0001 Глюкоза * катионы меди(И) 1,542 < 0,0001 Концентрация аминогуанидина * глюкоза * катионы меди (II) 5,099 < 0,0001 Рассмотрение данных об активности амино-гуанидина в условиях классической модельной системы гликирования в фосфатном буферном растворе свидетельствовало о проявлении ожидаемой активности аминогуанидина (ANOVA, пост-тест Туке, при уровне значимости р < 0,0001). Установленное значение IC50 соответствовало величине 3,5 мМ. Установленное IC50 укладывает с я в диапазон значений ранее установленной активности аминогуанидина [15]. Интерпретируя результат статистического анализа, можем заключить, что катионы меди являются независимым фактором усиления флуоресценции реакционной среды как в присутствии различных концентраций аминогуанидина, так и без него, с наивысшим показателем процента от общей дисперсии. Внесение катионов Cu (II) в среду реакции является фактором прироста флуоресценции в рассматриваемом эмиссионном диапазоне, при этом прирост в отсутствии аминогуани-дина в присутствии глюкозы несомненно связан с образованием КПГ (попарное сопоставление А и Б с Д и Е рис. 1). Внесение аминогуанидина в среду гликоксидации, содержащую катионы Cu (II), сопровождается значительным приростом флуоресценции (попарное сопоставление А и Б с В и Г рис. 1), тогда как внесение аминогуанидина в реакционную среду с HEPES, с глюкозой или без, с БСА, но без катионов Cu(II) - не вызывает выраженного прироста флуоресценции. Следовательно, образование флуоресцирующего продукта зависит от присутствия трех компонентов - аминогуанидина, катионов меди (II) и БСА. Надлежит отметить, что индекс флуоресценции I в среде гликоксидации с катионами Cu(II), определяемый по формуле (1), для аминогуанидина свидетельствует о наличии активности, и снижается ijcaeTDpfe ©©ffiTrf 0Щ>: по мере снижения концентрации аминогуанидина, составляя (72,8 ± 0,8), (68,3 ± 1,6), (63,9 ± 0,3) соответственно для концентраций 10, 3 и 1 мМ. Таким образом, не представляется возможным однозначно подтвердить факт потери активности в пользу предположения о наличии новообразованного продукта ввиду высокой относительной активности. В основе антигликирующего действия амино-гуанидина лежит его способность образовывать триазины и гидразоны с ди- и монокарбонильными соединениями (рис. 2). [17]. Упрощенная схема представлена на рис. 3. К подобным КПГ, образованным при участии фрагмента гуанидиновой группы аргинина, относятся пентозидин, имидазолон, глюкозепан, арг-п и рим идин [18]. Рис. 2. Реакция аминогуанидина с моно-и дикарбонильными соединениями В реакцию связывания карбонильных соединений вовлекаются как аминогруппа, так и иминовая группа соединения. Ведущую роль в связывании карбонильных групп берет на себя гидразиновая аминогруппа [16]. Образуемые триазины (рис. 2), согласно данным литературы, способны поглощать электромагнитное излучение в полосе 350430 нм и флуоресцируют при Aex 275, Aem 460480 нм, что по эмиссионному спектру близко к весперлизинам А и В и кросслину. Накоплением флуоресцирующих триазинов авторы [5] объясняют аномальное соотношение активности аминогуанидина при подавлении образования пентозидин-подобных и весперлизин-подобных КПГ. Однако в настоящем исследовании отобранный для детекции аргпиримидин имеет отличные от вес-перлизинов А и В спектральные характеристики, а потому версия о флуоресценции триазинов как объясняющая природу прироста флуоресценции не представляется вероятной. С учетом структуры аминогуанидина можно предположить, что в присутствии катионов меди (II) изменяется функциональная активность химических групп, в частности - гуанидиновой. В основе образования многих флуоресцирующих КПГ (включая аргпиримидин, рис. 3) лежит реакция конденсации между фрагментом гуанидиновой группы неизмененного аргинина и карбонильными соединениями Рис. 3. Обобщенная схема образования КПГ с участием фрагмента гуанидиновой группы аргинина (А) и имплементация процесса на реакцию образования аргпиримидина в реакции с метилглиоксалем (Б) Представляется возможным, что характер взаи модействия аминогуанидина с карбонильными соединениями (представленный на рис. 2), в присутствии катионов меди в среде гликоксидации изменяется. Если допустить, что (i) причина роста флуоресценции связана с образованием нового продукта, связанного с присутствием в среде реакции катионов Cu(II) и аминогуанидина; (ii) спектро-флуориметрические характеристики продукта характеризуют структуру гетероциклического ядра, как сходную со структурой КПГ; (iii) имеет место близость механизмов образования КПГ н а основе фрагмента гуанидиновой группы аргинина и нового продукта на основе фрагмента гуанидиновой группы аминогуанидина, то с учетом всего перечисленного можно выдвинуть гипотезу о том, что механизм реакции аминогуанидина в условиях описанной среды гликоксидации связан с главенствующим вкладом фрагмента гуанидиновой группы. И это может объяснять то, что обра з у е мая структура по спектрофлуориметрическим характеристикам идентична КПГ. Однако если учесть, что (i) прирост флуоресценции связан с образованием продукта взаимодействия аминогуанидина; (ii) реакция не зависит от присутствия глюкозы; (iii) реакция обусловлена только присутствием катионов меди (II) и аминогуанидина в среде с БСА, то можно предположить, что предшественник флуоресцирующего продукта, взаимодействующий с аминогуанидином, является трансформированным в результате окисления при участии катионов Cu(II) аминокислотным остатком. Возможность гуанидиновой группы вступать во взаимодействие с боковыми цепями является предметом дискуссии и отвергалась рядом исследователей [19, 20], однако следует учитывать, что в основе взаимодействия фрагмента гуанидиновой группы аминогуанидина лежит реакция не с нативным, а с трансформированным в результате окисления остатком. Однако вклад меди может быть обусловлен не только модификацией аминокислотного остатка. Согласно представленным в источниках литературы расчетным данным, в условиях образования комплекса меди с аминогуанидином возможно образование координационной связи активной аминогруппы с катионом (монодентатный и биден-татный комплексы) [21]. При этом требуемая для связывания карбонилов гидразиновая аминогруппа является приоритетной мишенью для образования координационного взаимодействия с катионами Cu(II) (рис. 2, рис. 4). Рис. 4. Фрагменты химических групп, составляющих молекулу аминогуанидина Возможность фрагмента гуанидиновой группы аминогуанидина в этих условиях приобретать сравнительно более высокую реакционноспособность, в частности по причине сохранения ее невовле-ченной или ее частичному вовлечению в комплек-сообразование, подлежит дальнейшему изучению. Это значит, что изменение характера активности может быть связано с особенностями координации катиона меди (II) и аминогуанидина. Доподлинно не ясно, является ли прирост флуоресценции следствием того, что аминогуани-дин в описанных условиях гликоксидации становится источником образования флуоресцирующего продукта или взаимодействие его с катионами меди вызывает усиление оксидативных процессов, что усиливает образование КПГ, но отсутствие глюкоза-зависимости снижает вероятность гипотезы усиленного образования нативных КПГ. С учетом особенностей флуоресценции образуемого продукта, зарегистрированной для длин волн, характерных для весперлизинов А и В (ранее представлено в [11]) и аргпиримидина (представлено в настоящей статье), можно заключить, что в рамках использованной экспериментальной модели величина регистрируемой антигликирующей активности аминогуанидина in vitro зависит от условий реакционной среды и снижается вплоть до полной потери в условиях гликоксидации в присутствии катионов меди (II), наблюдаемая реакция характерна для двух видов КПГ, дифференцированных в реакционной среде на основе спектрофлуори-метрических характеристик. Требуется более детально охарактеризовать получаемый продукт, однако отсутствие зависимости протекания реакции от наличия глюкозы указывает на то, что флуоресцирующий продукт образуется в результате взаимодействия аминогуанидина и трансформированных аминокислотных остатков или в результате изменения реакционной активности химических групп аминогуанидина после образования координационных связей. При этом надлежит вести дальнейшее исследование, является описанное свойство аминогуанидина следствием п р и роста концентрации КПГ-подобных структур, или флуоресценции молекулярных композиций, образуемых при участии аминогуанидина, и не имеющих общих свойств с КПГ. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В ходе настоящего исследования установлено, что в условиях реакции гликирования в присутствии катионов меди (II) (гликоксидации) катионы меди выступают фактором прироста флуоресценции реакционной среды, что связано как с однозначным приростом концентрации определяемого в эксперименте продукта гликирования аргпирими-дина, так и с образованием нового продукта, идентичного по спектрофлуориметрическим характеристикам аргпиримидину. При этом второй описанный продукт образуется только в реакционной среде, содержащей аминогуанидин, и только в условиях гл и коксидации в присутствии катионов Cu (II). Флуоресценция по характеристикам кривых «уровень флуоресценции, у.е.» - «длина волны испускания, нм» совпадает по характеристикам с спектральными характеристиками аргпиримидина. Образование флуоресцирующего продукта в присутствии аминогуанидина зависит от наличия в среде реакции катионов Cu (II), но не зависит от присутствия глюкозы. Относительная антигликирующая активность аминогуанидина, рассчитываемая с учетом флуоресценции проб идентичного состава, но без содержания глюкозы, остается сохранной.

Об авторах

Роман Александрович Литвинов

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; Волгоградский медицинский научный центр, лаборатория экспериментальной фармакологии

Email: litvinov.volggmu@mail.ru
к. м. н., доцент кафедры фармакологии и биоинформатики, с. н. с. лаборатории метаботропных лекарственных средств НЦИЛС ВолгГМУ, н. с. лаборатории экспериментальной фармакологии ГБУ ВМНЦ

Л. Э Усмиянова

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

лаборатория метаботропных лекарственных средств НЦИЛС ВолгГМУ

Д. Р Клименко

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

лаборатория метаботропных лекарственных средств НЦИЛС ВолгГМУ

А. В Гонтарева

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

лаборатория метаботропных лекарственных средств НЦИЛС ВолгГМУ

Список литературы

Дополнительные файлы