СHARACTERISTICS OF THE EXPRESSION OF ENDOTHELIAL NO-SYNTHASE IN THE DENTATE GYRUS OF RATS WHEN MODELING A DEPRESSIVE STATE AND THE POSSIBILITY OF PHARMACOLOGICAL CORRECTION WITH PHENIBUT

Full Text

Депрессия является одной из ведущих причин снижения трудоспособности населения и остается одним из самых распространенных психических расстройств в мире во всех возрастных группах [5]. Этиология и патофизиология основных депрессивных расстройств до конца не изучена. Нейрогенная гипотеза предполагает, что депрессия возникает в результате нарушения нейрогенеза в зубчатой извилине гиппокампа, в то время как эффекты антидепрессантов способны к его восстановлению [4]. Исследования на людях косвенно подтверждают данную теорию: у пациентов со стрессовыми расстройствами, включая депрессию, тревогу и посттравматическое стрессовое расстройство, наблюдаются меньшие объемы зубчатой извилины. Кроме того, у пациентов с депрессией, принимающих лекарства, наблюдается больший объем зубчатой извилины по сравнению с пациентами, которые не получали лечение [3]. Однако мало что известно о сложных механизмах, регулирующих нейрогенез у взрослых. Психоактивные соединения, стресс, возраст, физические упражнения, различные молекулы-м е с сенджеры, а также факторы роста и транскрипции задействованы в нейробиологии депрессии. Молекула газообразного переносчика оксида азота (NO) синтезируется из L-аргинина семейством из трех NO-синтаз (NOS): NOS-I (нейрональная), NOS-II (инду-цибельная) и NOS-III (эндотелиальная). NO выполняет несколько функций в центральной нервной системе, в том числе участвует в поведенческих процессах, таких как обучение и формирование памяти, играет важную роль в синапто- и морфогенезе головного мозга [6]. NOS локализуется в нейрогенных участках зубчатой извилины гиппокампа [2]. Хотя меньше исследований посвящено роли эндотелиальной NOS (eNOS) в процессах обучения и памяти, связанных с гиппокампом и зубчатой извилиной, известно, что eNOS может локализоваться не только в сосудах и нейронах гиппокампа [7], но и экспрессироваться в нейрональных клетках-предшественниках, оказывая влияние на нейрогенез [9]. Кроме того, доступные в настоящее время антидепрессанты не эффективны для значительного процента пациентов [5]. Таким образом, исследование роли NO-ергичес-кой системы в морфофункциональных изменениях зубчатой извилины необходимо для обнаружения новых молекулярных мишеней для лечения депрессии. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Выявить особенности экспрессии эндотелиальной NO-синтазы в зубчатой извилине у крыс зрелого возраста при моделировании депрессивного состояния, а также установить возможность фармакологической коррекции выявленных изменений фенибутом. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Работа была выполнена на крысах-самцах в возрасте 12 месяцев. Животные были получены из ФГУП «Питомник лабораторных животных ”Рапполово“» РАМН, Ленинградская область. Крысы были разделены на 3 группы: первая группа - контрольные животные (п = 10), вторая группа - группа «депрессия», то есть животные с экспериментальным депрессивным состоянием (п = 10), третья группа - «депрессия + фенибут», то есть крысы с экспериментальным депрессивным состоянием, получавшие фенибут (п = 10). Фенибут вводили внутрибрюшинно за час до моделирования депрессивного состояния в дозе 25 мг/кг. Первая и вторая группы животных получали соответственно массе эквивалентный объем физиологического раствора. При содержании животных, выполнении эксперимента и выведении их из эксперимента руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», Хельсинкской декларации (1975 г., 2000 г.). Депрессивное состояние у крыс моделировали путем мягкого стрессового воздействия в течение 7 дней (ежедневно по 30 мин). Действие стрессоров (вибрация, громкий звук, пульсирующий яркий свет) было непредсказуемым и осуществлялось в специальной камере, состоящей из 6 изолированных отсеков, в которые были помещены животные. Мягкое стрессовое воздействие приводит к формированию у животных стойкого депрессивного состояния, которое имеет феноменологическое сходство с клинической картиной депрессии [10]. Выведение животных из эксперимента осуществлялось с использованием «Гильотины для крыс» (AE0702, производитель Open Science, Россия). Для иммуни-г ис тохимического исследования головной мозг был ф и ксирован в нейтральном забуференном 10%-м формалине, изготовленные во фронтальной плоскости серийные парафиновые срезы толщиной 4 мкм изучали на уровне от -2,40 мм до -3,96 мм относительно брегмы. Для иммуногистохимического исследования использовали первичные поликлональные кроличьи антитела к eNOS (разведение 1 : 50; GeneTex, Inc., США). В качестве визуализации применяли полимерную с и сте му N-Histofine Simple Stain MAX PO (Nichirei Biosciences, Inc., Япония) и субстратную систему N-Histofine DAB-3S kit (Nichirei Biosciences, Inc., Япония). Оценку изменений уровня экспрессии eNOS в зубчатой извилине определяли в гранулярном и суб-гранулярном слоях путем оценки интенсивности окрашивания в баллах от 0 до 3 (0 - иммунонегатив-ная реакция; 1 - слабо выраженное окрашивание; 2 - умеренно выраженное окрашивание; 3 - максимально выраженное окрашивание). Исследование микропрепаратов проводилось с помощью микроскопа Axio Lab. A1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия), фотодокументирование осуществлялось камерой AxioCam 105 color (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия). Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов программ Statistica 6.0 (StatSoft, USA). Различия между группами оценивали по критерию Хи-квадрат (х2) и считали статистически значимыми при p < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При оценке результатов иммуногистохимичес-кой реакции у крыс контрольной группы в цитоплазме перикарионов нейронов гранулярного слоя зубчатой извилины определялась максимально выраженная цитоплазматическая экспрессия eNOS-иммунореак-тивного материала (ИРМ) (3 балла), в нейропиле гранулярного слоя экспрессия имела умеренно выраженный характер (2 балла). В цитоплазме нерв- отмечалась умеренно выраженная экспрессия eNOSных клеток и нейропиле субгранулярного слоя ИРМ (2 балла) (рис. А). ti&i У" ■ II « г. V, $ Рис. Гистологическое строение зубчатой извилины крыс в возрасте 12 месяцев. А - 1-я группа, «контроль»; Б - 2-я группа, «депрессия»; В - 3-я группа, «депрессия + фенибут». Иммуногистохимическое исследование, антитела против eNOS, окрашивание гематоксилином. Ув. * 400 У животных группы «депрессия», по сравнению с контрольной группой, отмечалось снижение экспрессии eNOS-ИРМ. Слабо выраженное окрашивание (1 балл) определялось в цитоплазме перикарионов нейронов гранулярного слоя, а также в нейропиле субгранулярного слоя. Иммунонегативная реакция (0 баллов) отмечалась в нейропиле гранулярного слоя и в нервных клетках субгранулярного слоя (рис. Б). При фармакологической коррекции депрессивного состояния у крыс фенибутом наблюдалось увеличение экспрессии eNOS-ИРМ по сравнению с группой «депрессия». Умеренно выраженная экспрессия (2 балла) определялась в цитоплазме перикарионов, нейропиле гранулярного слоя, а также в нейропиле субгранулярного слоя. В нервных клетках субграну-лярного слоя экспрессия eNOS-ИРМ отсутствовала (0 баллов) (рис. В). Проведенное нами иммуногистохимическое исследование продемонстрировало, что при мягком стрессовом воздействии, которое выражается у животных депрессивноподобной симптоматикой, отмечается снижение экспрессии eNOS в нервных клетках и нейропиле зубчатой извилины у крыс зрелого возраста, по сравнению с контрольной группой. Полученные нами морфологические данные подтверждают значимость наличия определенного базального уровня eNOS, который необходим в NO-ергическом механизме долговременной потенциации (LTP) в гиппокампе [8]. Chen и соавт. обнаружили, что количество образованных нейросфер при изучении тканевых культур, выделенных из субвентрикулярной зоны (SVZ) у животных с дефицитом eNOS, заметно снижается, а включение BrdU в SVZ нокаутных мышей по eNOS снижается после инсульта, что позволяет предположить, что eNOS, подобно nNOS, играет важную роль в пролиферации нейрональных клеток-предшествен-ников (NSC). Кроме того, нокаут eNOS может также подавлять миграцию NSC и рост нейритов в культуре тканевых эксплантатов SVZ. Результаты этих исследований подтверждают мнение о том, что eNOS и nNOS играют одинаковую роль в росте NSC, но только eNOS вносит вклад в миграцию NSC [1]. В данном исследовании нами было продемонстрировано, что применение фенибута у крыс зрелого возраста во время мягкого стрессового воздействия оказывает профилактический эффект и способствует увеличению экспрессии eNOS в нейронах гранулярного слоя, а также нейропиле гранулярного и субграну-лярного слоев зубчатой извилины, что, по-видимому, связано с его анксиолитической активностью. Согласно нейрогенной теории, различные препараты, уменьшающие депрессию и тревогу, также повышают нейрогенез в зубчатой извилине [4]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют, что при моделировании депрессивного состояния у крыс зрелого возраста наблюдается снижение экспрессии eNOS в нервных клетках и нейропиле зубчатой извилины. Применение фенибута оказывает корректирующее воздействие на компоненты NO-ергической системы, поскольку способствует увеличению уровня экспрессии eNOS.

About the authors

A. V Smirnov

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation; SBI «Volgograd Medical Scientific Center»

M. R Ekova

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: maria.ekova@mail.ru

I. N Tyurenkov

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

E. V Volotova

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

References

Supplementary files