ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КОСТНОЙ ТКАНИ И КРАСНОГО КОСТНОГО МОЗГА ПРИ ОСТРОМ ГЕМАТОГЕННОМ ОСТЕОМИЕЛИТЕ У ДЕТЕЙ

Полный текст

Проблема диагностики и лечения гематогенного остеомиелита у детей остается наиболее актуальной задачей для практикующих хирургов и травматологов [2, 8]. Частота встречаемости гематогенного остеомиелита в структуре гнойно-хирургических заболеваний варьирует и, по данным разных источников, составляет более 15 % [2]. Так, острый гематогенный остеомиелит (ОГО) встречается у каждого 5 ребенка на 100 000 детского населения. Несмотря на достижения современной науки, методы исследования не всегда способны вовремя диагностировать ОГО у детей, что способствует быстрому переходу острой формы гематогенного остеомиелита в хроническую, а это, в свою очередь, ведет к высокому проценту (70-87 %) инвали-дизации [2]. В научной литературе существует ограниченное число работ, посвященных ранней диагностике ОГО у детей на основе использования морфофункциональных характеристик костной ткани [7]. Изучение особенностей иммунологической реактивности детей разного возраста при ОГО является очень важным для понимания иммунопатогенеза заболевания. Так, в проведенных исследованиях (Смирнов И.Е., Рошаль Л.М., Кучеренко А.Г. и др.) авторы отмечают значимую роль дисбаланса количественных показателей субпопуляционного состава лимфоцитов при гематогенном остеомиелите у детей: увеличение содержания субпопуляции Т-хелперных лимфоцитов 2-го типа отражает преимущественную направленность иммунного ответа у детей с ОГО на развитие гуморального ответа с повышением продукции интерлейкинов [6]. В других работах в формировании хронического процесса важная роль отводится высокодифференцированным клеткам памяти и экспрессии CD8+ [4, 5]. По мнению некоторых ученых, развитие различных форм гематогенного остеомиелита связано не только с дефектом отдельных звеньев иммунной системы, но и с ее гиперактивацией на фоне общей иммунносупрессии организма [1]. Существование аутоиммунного компонента в патогенезе остеомиелита с представлением возможности прогнозирования течения остеомиелита в зависимости от разного уровня супрессии Т-звена иммунной системы и степени гиперактивации В-звена также отражено в ряде исследований [3, 7]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Проведение гистологического и иммуногистохи-мического анализа костной ткани и красного костного мозга при остром гематогенном остеомиелите у детей. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ В отделении хирургии ГБУЗ СК «Краевая детская клиническая больница» г. Ставрополя находились на лечении 73 ребенка с диагнозом «острый гематогенный остеомиелит» (с 2013 по 2019 г.). Для выполнения исследовательской работы были получены добровольное информированное согласие родителей пациентов и разрешение локального этического комитета ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол № 68 от 22 апреля 2013 г.). Всем пациентам было проведено экстренное хирургическое вмешательство, выполнена остеоперфорация пораженной кости. Произведен забор костной ткани и биоптата красного костного мозга для гистологического и ИГХ-исследования. Материал биоптата доставлен в лабораторию в течение 6 часов с момента забора. Полученные образцы фиксировали в 10%-м забуференном формалине, затем дегидратировали и заключали в парафин по стандартной методике. Гистологические срезы толщиной 7-8 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону. ИГХ-исследование осуществляли по стандартному протоколу с использованием кроличьих моноклональных антител к Т-лимфоцитам, в том числе, Т-хелперам и Т-цитотоксическим клеткам. Для этого использовали концентрированные антитела к CD3+, клон СВС.37 (Diagnostic BioSystems, США), к CD4+, клон 1f6 (Bond RTU Primary, Leica Biosystems, США), в разведении 1:30 и к CD8+, клон 144В (Bond RTU Primary, Leica Biosystems, США) в разведении 1:50. ИГХ-исследование выполнялось на иммуногистостей-нере Leica Bond maX (Leica Biosystems, Великобритания) с применением системы детекции Bond Polymer Refine Detection (Leica Biosystems, Великобритания). При выполнении ИГХ-исследования костного мозга для выявления пусковых факторов, являющихся предикторами хронизации гематогенного остеомиелита, особое внимание уделялось расчету площади, занятой иммунопозитивными структурами. Интенсивность экспрессии при ИГХ исследовании иммунореактивного материала в лимфоцитах оценивали полуколичественным методом по интенсивности окрашивания: 0 - реакция отсутствует; 1 - слабая экспрессия; 2 - реакция умеренная; 3 - реакция интенсивная. Для оценки экспрессии CD3+, CD4+, CD8+-маркеров и их прогностического значения использовали метод, предложенный Л.Е. Гуревич (2003). Для оценки прогностического значения описанных типов экспрессии в клетках была использована следующая шкала: отсутствие иммунореактивности -0 баллов; мембранный тип - 1 балл; сочетание мембранного типа с гранулярно-цитоплазматическим -2 балла; крупногранулярный тип - 3 балла. Для количественной оценки результатов иммуно-гистохимического исследования получали по 10 микрофотографий соответственно 10 случайно выбранным полям зрения на увеличении *200 для каждого образца. В дальнейшем с помощью программы компьютерного анализа изображений «Морфология 5.0» (ВидеоТест, Россия) оценивали площадь, занятую иммунопозитивными структурами, относили ее к общей площади кадра и рассчитывали показатель относительной площади (в %), который выражал экспрессию исследуемых маркеров. Статистическая обработка результатов исследований проводилась с помощью программ Excel 2010 (Microsoft, США) и Statistica 10.0 (StatSoft, США). Для оценки достоверности различий количественных показателей применяли критерий Пирсона (х2), критерий Стьюдента с применением методов вариационной статистики и непараметрический критерий Манна - Уитни. Различия признавали достоверными при p < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При гистологическом исследовании в биоптате костной ткани наблюдали формирование сладж-феномена (депонирования крови в сосудах) с одновременным повышением проницаемости сосудистой стенки, выходом лимфоцитов и макрофагов в окружающую ткань. Отмечали формирование отека вследствие накопления серозного экссудата внутри гаверсовых каналов. Выявили начальные явления гладкой резорбции костных балок без участия остеокластов под воздействием экссудата и вследствие формирования микроциркуляторных расстройств. В костном мозге определили очаги геморрагий с большим количеством нейтрофильных лейкоцитов, моноцитов и эритроцитов. Установленные гистологические изменения костной ткани характерны для интра-медуллярной фазы ОГО в периоде сосудистых расстройств и свидетельствует о развитии заболевания в течение первых суток. При исследовании биоптата костной ткани, взятого в более поздние сроки от начала заболевания, между костными балками наблюдали формирование крупных гнойных очагов, сообщающихся между собой. Отмечали расширение гаверсовых и фолькмановых каналов за счет неравномерного скопления экссудата, порознозность костной ткани. В препаратах красного костного мозга определяли элементы стромы красного и желтого костного мозга с диффузной обильной лейкоцитарной инфильтрацией, кровоизлияния в костномозговые пространства (рис. 1). Рис. 1. Элементы желтого и красного костного мозга с диффузной обильной лейкоцитарной инфильтрацией. Окраска: гематоксилин и эозин, увеличение: ок. 10, об. 20 В биоптатах костной ткани выявили микропереломы костных балок (рис. 2), участки некроза костных балок, обширные зоны резко выраженного аутолити-ч еско го рассасывания, что соответствует экстраме-дуллярной фазе ОГО. Рис. 2. Зона резорбции костной ткани, патологические микропереломы костных балок. Окраска: гематоксилин и эозином, увеличение: ок. 10, об. 20 Экспрессия иммуннореактивного материала -CD3+ в красном костном мозге в экстрамедуллярной фазе ОГО интенсивная (3 балла). Иммуннореактивный материал мелкогранулярный, рассеянный в цитоплазме клеток в сочетании мембранного типа с гранулярно-цитоплазматическим (2 балла). CD3+ лимфоциты визуализировали в красном костном мозге повсеместно, единичными элементами или небольшими скоплениями клеток в количестве от 2 до 4 между волокнами ретикулярной ткани и в инфильтрате вокруг свищевого хода. В зонах роста молодой грануляционной ткани между клетками и внеклеточным матриксом отмечали формирование небольших «клеточных дорожек» CD3+ клеток (рис. 3). Экспрессия маркера Т-лимфоцитов-хелперов, или CD4+ в экстрамедуллярной фазе ОГО умеренная (2 балла). Иммунореактивный материал мелкогранулярный, цитоплазматически рассеянный, в сочетании мембранного типа с гранулярно-цитоплазматическим (2 балла). CD4+ лимфоциты в красном костном мозге выявили повсеместно. Клетки были локализованы поодиночке, в основном сопровождая артериолы. Кроме периваскулярной локализации, CD4+ клетки окружали область свищевого хода. Наблюдали продвижение CD4+ лимфоцитов вместе с молодой грануляционной тканью в область патологического очага (рис. 4). Экспрессия маркера цитотоксических Т-лимфо-цитов, или CD8+ в экстрамедуллярной фазе ОГО умеренная (2 балла). Иммунореактивный материал -крупногранулярный, цитоплазматически рассеянный (3 балла). Регистрировали скопления CD8+ лимфоцитов в количестве от 4-6 до 20-30. Данные лимфоциты сопровождали кровеносные сосуды микроциркуля-торного русла, либо окружали их плотным кольцом, либо встраивались в их стенку. Возле единичных кровеносных сосудов отмечали скопления CD8+ лимфоцитов в виде цепочек клеток из 25-35 элементов, анастомозирующих между собой. Выявили движение Рис. 3. Скопления CD3+ клеток в воспалительном инфильтрате (ИГХ-реакция на CD3+). Продукт реакции коричневого цвета, увеличение: ок. 10, об. 40 Рис. 4. CD4+ клетки в области стенки свищевого хода. ИГХ-реакция на CD4+. Продукт реакции коричневого цвета, увеличение: ок. 10, об. 20 CD8+ клеток в очаг воспаления. Единичными элементами отмечали CD8+ лимфоциты в зоне стенки свищевого хода между внеклеточным матриксом грануляционной ткани. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, признаки концентрации субпопуляций лимфоцитов, в частности, популяции эф-фекторных Т-клеток, или CD3+/CD4+/CD8+-лимфоцитов в красном костном мозге при остром гематогенном остеомиелите у детей свидетельствует о снижении иммунорегуляторного индекса организма в целом и указывает на наличие тяжелого воспалительного процесса и угрозе развития осложнений.

Об авторах

Алла Григорьевна Сирак

ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: sergejsirak@yandex.ru
д. м. н., профессор, зав. кафедрой гистологии

А. Н Григорова

ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра гистологии

М. О Диденко

ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра гистологии

М. А Долгашова

ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра гистологии

Н. Н Диденко

ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра гистологии

Е. И Пискарева

ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра гистологии

Е. И Пашнева

ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра гистологии

О. Г Магомедова

ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра гистологии

А. П Арутюнова

ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра гистологии

Список литературы

Дополнительные файлы