ОЦЕНКА ЛЕНТИКУЛЫ РОГОВИЦЫ ЧЕЛОВЕКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭЛЕКТРОННОЙ И ЛАЗЕРНОЙ СКАНИРУЮЩЕЙ МИКРОСКОПИИ, ПОЛУЧЕННОЙ ПРИ ФЕМТОЛАЗЕРНОЙ КОРРЕКЦИИ МИОПИИ
- Авторы: Писаревская О.В.1, Судаков Н.П2, Лопатин А.П.2
-
Учреждения:
- Иркутский филиал ФГАУ НМИЦ «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России
- ФГБУН «Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук»
- Выпуск: Том 18, № 3 (2021)
- Страницы: 28-32
- Раздел: Статьи
- URL: https://journals.eco-vector.com/1994-9480/article/view/119666
- DOI: https://doi.org/10.19163/1994-9480-2021-3(79)-28-32
- ID: 119666
Цитировать
Полный текст
Аннотация
В настоящее время наиболее распространенной, безопасной и комфортной операцией по коррекции миопии является технология экстракции лентикулы через малый доступ. Короткий период реабилитации и стабильность результата данной технологии объясняется минимальным повреждением коллагеновых волокон, активацией и дегенеративными изменениями кератоцитов, которые в большинстве случаев имеют обратимый характер.
Ключевые слова
Полный текст
Фемтосекундная экстракция лентикулы через малый доступ является операцией выбора при коррекции близорукости и миопического астигматизма. Основными преимуществами данной технологии является высокий рефракционный результат и его стабильность, устойчивость и высокие характеристики опорных свойств роговицы [5, 7], что в целом зависит от состояния коллагеновых волокон, структуры кератоцитов, участвующих в синтезе и поддержании внеклеточного матрикса [6, 8, 9]. Для комфорта пациентов во время операции, для устранения дискомфорта используется местная анестезия, позволяющая эффективно справиться с поставленной задачей [4]. Исследования Nicolaus Luft лентикул, извлеченных в ходе проведения операции SMILE у человека, выявили снижение концентрации противовоспалительных цитокинов (IL-1 b, TNF а), наличие единичных измененных стромальных кератоцитов с TUNEL-положительным результатом, отражающих их апоптотическую гибель [1]. Однако полученные результаты не позволяют однозначно ответить на вопрос о механизмах послеоперационного заживления после операции SMILE и формирования предпосылок к регрессу рефракционного эффекта [2, 3]. В связи с этим выяснение особенностей альтерации стромы роговицы в ответ на фемтосекундную экстракцию роговичной лентикулы через малый разрез является весьма актуальным. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Оценить информативность ультраструктурных и иммуногистохимических исследований лентику-лы роговицы, полученной в ходе рефракционной операции SMILE. Исследования процессов заживления после SMILE, проведенные на модели кроликов, показали, что фемтосекундные операции сопровождаются умеренной экспрессией Ю-67 положительных клеток к фибронек-тину и антител к антигену СD11b, которые, с одной стороны, участвуют в создании временной матрицы для миграции эпителиальных клеток или кератоцитов в зону повреждения, а с другой - отражают степень воспалительной реакции и пролиферации [11, 10]. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Проведено исследование 6 лентикул роговицы, полученных в ходе плановых операций по коррекции зрения с помощью фемтосекундного лазера Visumax Carl Zeiss, Германия по технологии Смайл, основанной на формировании в строме роговицы линзы толщиной от 89 до 124 мкм, с роговичным клапаном от 100 до 130 мкм, диаметром оптической зоны 7 мм и размером роговичного доступа 2,38 мм. Лазерный этап операции проводился с использованием режима Fast (энергия 180 nJ, точечный интервал 4,5 цт), механическое разделение ткани проводилось с помощью шпателя Geuder AG, Германия, удаление лентикулы - с помощью одноразового зубчатого пинцета, 23 G DORC, Нидерланды. Степень исходной миопии варьировала от 4,0 до 6,0 дптр. Все операции выполнены одним хирургом. Для оценки микроструктуры и биохимических изменений тканей использовалась сканирующая, просвечивающаяся, лазерная конфокальная микроскопия с оценкой актина, нейтральных липидов и ядер клеток. Для просвечивающей микроскопии лентикулы из роговицы глаза фиксировали в 2,5%-м растворе глутаро-вого альдегида (Sigma-Aldrich, USA) на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4) (1 ч), промывали тем же буфером (3 раза по 10 мин), 12 часов дофиксировали 2%-м раствором четырехокиси осмия (Sigma-Aldrich, USA) и заливали в эпоксидную смолу. После полимеризации на ультрамикротоме Ultracut R (Leica) изготавливали ультратонкие срезы (70-80 нм), которые исследовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа Leo 906 E (Zeiss, Германия). Для изучения поверхностных структур лентикулы фиксировали по вышеописанной методике и обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (30, 50, 70, 96, 100 %). После обезвоживания материал исследовали в сканирующем электронном микроскопе Quanta 200 (FEI Company). Рис. 1. Лентикула, выделенная из роговицы по данным сканирующей электронной микроскопии Для лазерной конфокальной микроскопии лен-тикулы отмывали в среде 199 и фиксировали 15 мин в 4%-м параформальдегиде (Sigma-Aldrich, USA). Для визуализации актиновых микрофиламентов материал после фиксации пермеабилизовали 20 мин в 1%-м растворе Тритона Х100 (Sigma-Aldrich, USA) и обрабатывали фаллоидином-FITC (ex/em 490/525 nm) 40 мин. Для выявления ядер клеток материал окрашивали DAPI (Sigma-Aldrich, USA, ex/em 340/488 nm), 0,5 мкг/мл в течение 15 мин. Все изображения, полученные с помощью LSM 710 (Zeiss), обрабатывали с помощью двух программ: ZEN 2010 (Zeiss) и Imaris® Bitplane 7.2.3. Всю полученную по каждому из выделенных фрагментов информацию суммировали и обрабатывали методами непараметрической статистики, применяя пакет программ Statistica 10 и Microsoft Excel 2010. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Лентикула, выделенная из роговицы человека, имеет размеры 5 х 3,5 мм (рис. 1). По данным просвечивающей электронной микроскопии основная масса межклеточного матрикса стромы лентикулы представлена разнонаправленно ориентированными слоями волокон коллагена. В некоторых участках стромы такие нити формировали более плотные скопления, которые располагались в непосредственной близости с клеточными элементами либо в свободном межклеточном пространстве лентикулы (рис. 2). Характерно, что, по данным конфокальной микроскопии, окраска препаратов фаллоидином, меченным FITC, дает положительную реакцию на актино-вые микрофиламенты во внеклеточном пространстве. к к к Рис. 2. Участки плотно расположенных сетей (показаны стрелками) мелкоструктурированных филаментов внеклеточного матрикса в строме лентикулы Это говорит о том, что в матриксе стромы лентикулы могут присутствовать области, содержащие кластеры F-актина - биополимера, характерного преимущественно для внутриклеточной среды (рис. 3). 130 AV 120 110 100 -V 90 80 * 70 Y [urn] 60 50 40 30 V 20 10 02 fuml ОС ) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 X [urn] Рис. 3. Оптический срез стромы лентикулы с ядрами (DAPI, синий) кератоцитов и актиновыми микрофиламентами (фаллоидин-FITC, зеленый), которые отмечены стрелками. Лазерная конфокальная микроскопия В толще стромы среди пучков коллагена выявляются также отдельные, расположенные вдоль плоскости лентикулы кератоциты. Основную часть этих клеток занимает крупное, вытянутое вдоль клетки ядро с неровными краями. К внутренней стороне ядерной мембраны плотным слоем примыкает фибриллярная сеть ядерной ламины. В матриксе ядра среди глыбок хроматина выявляется хорошо выраженное ядрышко. Такая структура ядерного вещества обычно не свойственна для жизнеспособных кератоцитов в норме и может быть связана с коагуляцией белков, вызванной локальным воздействием лазера в процессе формирования лентикулы. В цитоплазме отчетливо выявляются компоненты цитоскелета, детальный состав которого возможно определить только с помощью подробного иммуно-цитохимического анализа (рис. 4). Селективная окраска клеток фаллоидином-FITC (см. рис. 3) показывает, что одним из распространенных компонентов цитоскелета кератоцитов являются актиновые микрофиламенты. Рис. 4. Нити цитоскелета в цитоплазме кератоцита отмечены стрелкой Судя по данным трансмиссионной микроскопии, среди нативных кератоцитов выявляются также клетки, которые по морфологическим признакам соответствуют клеткам в состоянии апоптоза, или аутофагии. Сканирующая электронная микроскопия вогнутых и выпуклых фрагментов лентикул показала, что их поверхность имеет выраженный рельеф в той или иной степени упорядоченной ребристой структуры (рис. 5). Возможно, что данный рельеф отражает направленность нитей коллагена в слоях матрикса, составляющих строму лентикулы, что согласуется с данными, полученными с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Рис. 5. Ультраструктура вогнутой поверхности лентикулы. Сканирующая электронная микроскопия Биологические механизмы, лежащие в основе повреждения и заживления ран роговицы, в том числе и после рефракционных операций, являются ключевым фактором, определяющим течение послеоперационного периода, рефракционный эффект и остроту зрения пациентов. Проведенные исследования позволили выявить на поверхности лентикулы многочисленные игольчатые структуры, которые, судя по их размерам и локализации, представляют собой механически разорванные коллагеновые микрофибриллы и волокна, которые осуществляли интрастромальные связи между параллельными коллагеновыми пластинами. Прямое локальное воздействие фемтосекундного лазера сопровождается патологическими изменениями некоторых кератоцитов, при исследовании которых установлены признаки обратимых и необратимых дегенеративных изменений. Кроме того, было показано, что в лентикуле присутствуют кератоциты, содержащие Ф-актин в цитоплазме. Этот факт имеет двойное значение. Прежде всего, он свидетельствует о способности кератоцитов продуцировать Ф-актин и, вероятно, секретировать его в межклеточное пространство, принимая участие в регуляции актин-опосредуемого апоптоза. Кроме того, накопление Ф-актина в цитоплазме кератоцитов указывает на дифференцировку этих клеток в миофибробласты. Известно, что керато-циты в разреженной среде начинают превращаться в так называемый «ремонтный фенотип» и в миофибробласты, активно секретирующие элементы внеклеточного матрикса. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, операция, проведенная по технологии SMILE, основанная на фемтосекундной фотоде-струкциии с последующим механическим разделением ткани роговицы, характеризуется минимальным повреждением коллагеновых волокон, активацией и дегенеративными изменениями кератоцитов. Все выявленные изменения клеток и внеклеточного матрикса наблюдаются только вдоль передней и задней поверхности лентикулы.×
Об авторах
Олеся Валерьевна Писаревская
Иркутский филиал ФГАУ НМИЦ «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России
Email: lesya_pisarevsk@mail.ru
к. м. н., заведующая рефракционным отделением, врач-офтальмолог высшей категории Иркутск
Н. П Судаков
ФГБУН «Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук»Иркутск
А. П. Лопатин
ФГБУН «Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук»Иркутск
Список литературы
- Писаревская О.В., Щуко А.Г., Юрьева Т.Н. SMILE -инновационная технология в рефракционной хирургии // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2016. - № 3 (65). -С. 76-78.
- Писаревская О.В., Щуко А.Г., Юрьева Т.Н. и др. Экстракция лентикулы через малый разрез - новая технология в рефракционной хирургии // Практическая медицина. - 2015. - № 2-1 (87). - С. 124-126.
- Щуко А.Г., Писаревская О.В., Букина В.В., Юрьева Т.Н. Эффективность и безопасность технологии SMILE в рефракционной хирургии // Современные технологии в офтальмологии. - 2014. - № 3. - С. 236-239.
- Щуко А.Г., Хлебникова Л.С., Олещенко И.Г. и др. Место инсталляционной анестезии в рефракционной хирургии у детей // Офтальмология. - 2018. - Т. 15, № S2. - С. 82-88.
- Blum M., Taubig K., Gruhn C., et al. Five-year results of small incision lenticule extraction (ReLEx SMILE) // British Journal of Ophthalmology // British J Ophthalmol. - 2016. -No. 100 (9). - P. 1192-1195.
- Faussone Pellegrini M.S., Popescu L.M. Telocytes // Biomol Concepts. - 2011. - No. 2. - P. 481-489.
- Guo H., Hosseini-Moghaddam S.M., Hodge W. Corneal biomechanical properties after SMILE versus FLEX, LASIK, LASEK, or PRK: a systematic review and meta-analysis // BMC Ophthalmol. - 2019. - No. 19 (1). - P. 167.
- Holmes D.F., Gilpin C.J., Baldock C., et al. Corneal collagen fibril structure in three dimensions: Structural insights into fibril assembly, mechanical properties, and tissue organization // Proc Natl Acad Sci U. S. A. - 2001. - No. 98 (13). -P. 7307-7312.
- Meek K.M., Knupp C. Corneal structure and transparency // Prog Retin Eye Res. - 2015. - No. 49. - P. 1-16.
- Nishida T. The role of fibronectin in corneal wound healing explored by a physician-scientist // Jpn J Ophthalmol. - 2012. - No. 56 (5). - P. 417-431.
- Tervo K., van Setten G.B., Beuerman R.W., et al. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics // Invest Ophthalmol Vis Sci. -1991. - No. 32 (11). - P. 2912-2828.