Структурно-функциональные особенности гемоглобина крови доноров в присутствии доксициклина и мексидола
- Авторы: Баева Е.С.1, Артюхов В.С.2, Куркина О.С.2
-
Учреждения:
- Воронежский государственный медицинский университет имени Н.Н. Бурденко
- Воронежский государственный университет
- Выпуск: Том 20, № 4 (2023)
- Страницы: 122-126
- Раздел: Оригинальные исследования
- URL: https://journals.eco-vector.com/1994-9480/article/view/626101
- DOI: https://doi.org/10.19163/1994-9480-2023-20-4-122-126
- ID: 626101
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Методом спектрофотометрии исследовано влияние растворов мексидола (4,47 × 10-6 мкг/мл), доксициклина гидрохлорида (8,75 × 10-7 мкг/мл) и нитрита натрия (0,14 г/мл) на структурное состояние молекул оксигемоглобина человека. Показано, что наличие модификаторов в инкубационной среде в сочетании и по отдельности способствует их определенному сродству к молекуле гемоглобина, что находит отражение в изменении соотношения лигандных форм гемопротеида. Выявлена тенденция к снижению уровня метгемоглобинообразования в образцах, содержащих доксициклин и мексидол. Предварительная инкубация растворов гемоглобина с исследуемым антибиотиком способствует уменьшению окислительного эффекта нитрита натрия в отношении молекул гемопротеида. Полученные данные подтверждают концепцию наличия неантибактериальных эффектов доксициклина.
Ключевые слова
Полный текст
Использование лекарственных препаратов в практической медицине нередко сопровождается проявлением последними побочных эффектов различной этиологии. В последнее время появляется все большее количество работ, доказывающих негативное влияние терапевтических агентов на компоненты крови человека. Изменение кислородтранспортных и иных свойств эритроцитов – залог снижения адаптивных возможностей организма и, в конечном итоге, его функциональных резервов. Исследование взаимосвязи изменения структурно-функциональных свойств форменных элементов крови от присутствия модификаторов в инкубационной среде позволит выявить пути повышения их терапевтической эффективности и снизить вероятность проявления нежелательных эффектов.
В нормальной физиологии перекисное окисление липидов является важной составляющей частью системы регуляции. Однако, выходя за определенные пределы, процесс приобретает патогенетичекий характер, который проявляется денатурацией и инактивацией белка, делипидизацией мембраны, нарушением клеточного деления и роста клетки. Эти и другие действия контролируются антиоксидантной системой, которая играет важную роль в регуляции протекания свободно-радикальных превращений в организме, существенно влияя на его состояние. Поэтому антиоксиданты и исследование антиокислительных свойств различных соединений в последнее время получили широкое распространение.
Среди известных веществ, обладающих антиоксидантной защитой, обладает мексидол – 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат – мощный ингибитор процессов перекисного окисления липидов, нейтрализующий свободные радикалы, активирующий супероксиддисмутазу и глутатионпероксидазу [1]. В присутствии мексидола активизируется сукцинатоксидазный путь окисления, что на ранних стадиях гипоксии в условиях ограничения НАД-зависимого окисления позволяет сохранить в митохондриях определенный уровень окислительного фосфорилирования. Фармакологические эффекты мексидола реализуются на сосудистом и нейрональном уровнях, оказывая антигипоксантное, анксиолитическое, антистрессорное, нейропротективное, ноотропное и ряд других действий [1, 2].
Антибиотику тетрациклиновой группы – доксициклину (ДЦ) – по некоторым данным – присуще наличие так называемых неантибактериальных свойств, выражающихся не только во влиянии на иммунные реакции организма, но и белково-липидные компоненты его клеточных мембран [3, 4, 5], а также цитоархитектонику эритроцитов человека [6].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить структурно-функциональные свойства гемоглобина, выделенного из эритроцитов донорской крови в условиях его предварительной инкубации модифицирующими агентами – мексидолом, доксициклином, нитритом натрия – по отдельности и в их сочетании.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Забор образцов крови (n = 20) осуществляли на Воронежской областной станции переливания в пробирки с гепарином натрия (Синтез, Россия) (+4 °С). В основе расчета концентрации модификаторов – разовая доза препаратов (8,75 × 10-7 мкг/мл ДЦ, 4,47 × 10-6 мкг/мл мексидола). Навеску ДЦ гидрохлорида (Sigma Aldrich), как и мексидола (Фармасофт), растворяли в заданном объеме 0,9%-го раствора NaCl. В цельную кровь объемом 150 мкл добавляли совместно или по отдельности препараты, осторожно перемешивали и хранили в холодильнике при температуре +4 °С в течение 60 мин для антибиотика и 10 мин для нитрита натрия и мексидола. В общей сумме получали 10 образцов с различными комплексами «цельная кровь – модифицирующие агенты» (табл.).
Последовательность введения модификаторов в растворы оксигемоглобина человека (цифрами в скобках указан порядок использования раствора)
Пробирка | Кровь, мкл | Раствор ДЦ, мкл | Раствор мексидола, мкл | Раствор NaNO2, мкл | NaCl (0.9 %) мкл |
1 | 150 | – | – | – | 20 |
2 | 150 | – | – | 10 | 10 |
3 | 150 | – | 10 (2) | 10 (1) | – |
4 | 150 | 10 (2) | – | 10 (1) | – |
5 | 150 | – | 10 | – | 10 |
6 | 150 | – | 10 (1) | 10 (2) | – |
7 | 150 | 10 (2) | 10 (1) | – | – |
8 | 150 | 10 | – | – | 10 |
9 | 150 | 10 (1) | – | 10 (2) | – |
10 | 150 | 10 (1) | 10 (2) | – | – |
Для получения растворов гемоглобина цельную донорскую кровь с модифицирующими агентами промывали изотоническим раствором NaCl, центрифугировали в течение 5 минут со скоростью 3000 об./мин на центрифуге MiniSpin. К осадку эритроцитов в качестве гемолизирующего агента добавляли дистиллированную воду, клетки осаждали в течение 10 мин при 12 000 об./мин. Полученный раствор гемоглобина доводили до оптической плотности D ~ 0,8. Регистрацию электронных спектров поглощения растворов нативного и модифицированного гемоглобина проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-401PC в диапазоне длин волн от 200 до 750 нм (через 1 нм). Статистическую обработку данных проводили с помощью прикладных пакетов Microsoft Excel. Концентрации лигандных форм гемоглобина определяли, используя величины изменения спектральных характеристик и эмпирических формул [3, 4].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Методом спектрофотометрии проведена регистрация спектральных характеристик исследуемых модификаторов (рис. 1).
Как следует из представленных данных, мексидол характеризуется наличием четко различимых пиков в области 200, 295 нм, а ДЦ – при 272 и 345 нм. Установлено, что молекулы мексидола не вызывают значительных изменений в молекуле гемоглобина человека (рис. 2).
Рис. 1. Спектры поглощения растворов мексидола и доксициклина гидрохлорида
Рис. 2. Спектры поглощения растворов оксигемоглобина в присутствии мексидола и доксициклина гидрохлорида
В то же время сочетанное его использование с ДЦ способствует перераспределению электронной плотности в белковой области спектра, что может быть объяснено комплексированием модификаторов с молекулами гембелка. Последовательное введение в раствор мексидола и ДЦ, либо ДЦ и мексидола вызывает изменения спектральных свойств, проявляющиеся при длинах волн λ = 272 нм и 342 нм. Исходя из этого, можно отметить, что белковая часть гемоглобина может изменять свои структурно-функциональные особенности и расположение гемового кармана. Введение в среду нитрита натрия способствует окислению гемоглобина, что подтверждается высокой интенсивностью полос поглощения при 408 и 630 нм (рис. 3).
Обращает на себя внимание тот факт, что при взаимодействии модифицированной ДЦ крови с нитритом натрия выявляется наименьшая степень окисления железа (38,4 %) по сравнению с другими исследованными образцами.
На основании исследования спектральных характеристик растворов оксигемоглобина человека, модифицированных ДЦ, мексидолом и нитритом натрия, установлено изменение соотношения лигандных форм гемопротеида в растворе (рис. 4).
Рис 3. Спектры поглощения растворов гемоглобина в присутствии модификаторов: 1 – контроль (нормальный спектр); 2 – HbO2+NaNO2, 3 – HbO2+ NaNO2+Мексидол, 4 – HbO2+ NaNO2+ ДЦ (р < 0,05)
Рис. 4. Соотношение лигандных форм гемоглобина в растворе: ДЦ – доксициклин, М – мексидол (р < 0,05)
Следовательно, последовательность введения модификаторов в растворы гемоглобина оказывает прямое влияние на структурно-функциональное состояние последнего, а следовательно, и на его способность связывать и удерживать кислород. Полученные данные доказывают факт взаимодействия ДЦ с белково-липидными компонентами гемоглобина человека, проявляющийся в перераспределении электронной плотности в молекулах гембелка. По-видимому, наименьший уровень образования метгемоглобина (41,3%) достигнут в результате конкурентного связывания нитрит-ионов с гемовым карманом гембелка в сравнении с другими растворами, содержащими нитрит натрия (47,4 %, 53,4 %). Таким образом, ДЦ может оказывать защитный эффект от окислителей, таких как нитрит натрия, что требует продолжения исследований в данной области.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Индуцированное модификаторами изменение спектральных свойств оксигемоглобина, по-видимому, является отражением волны конформационных изменений на уровне гема и глобина, что сопровождается частичным отрывом лиганда (О2) от молекулы белка. На клеточном уровне подобные процессы могут найти отражение в изменении кислородтранспортной способности эритроцитов (их частичная деоксигенация), а повышенное сродство ДЦ к молекулам гемопротеида, обнаруженное в наших модельных системах, потенциально затронет состояние белково-липидных компонентов клеток крови.
Об авторах
Елена Сергеевна Баева
Воронежский государственный медицинский университет имени Н.Н. Бурденко
Автор, ответственный за переписку.
Email: galaxy1985@mail.ru
кандидат биологических наук, доцент кафедры нормальной физиологии
Россия, ВоронежВалерий Сергеевна Артюхов
Воронежский государственный университет
Email: artyukhov@bio.vsu.ru
доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой биофизики и биотехнологии
Россия, ВоронежОльга Сергеевна Куркина
Воронежский государственный университет
Email: kuurochka@gmail.com
магистр кафедры биофизики и биотехнологии
Россия, ВоронежСписок литературы
- Shchukin I.A., Fidler M.S., Koltsov I.A., Suvorov A.Y. COVID-19-Associated Stroke. Neurosci Behav Physiol. 2022; 52(5):649–656.
- Громова О.А., Торшин И.Ю., Стаховская Л.В. и др. Опыт применения мексидола в неврологической практике. Журнал неврологии и психиатрии. 2018;10:94–104.
- Стусь Л.К., Розанова Е.Д. Осцилляция форм гемоглобина в процессе хранения крови. Биофизика. 1992;37(2):387– 388.
- Golub L.M., Elburki M.S., Walker C. et al. Non-antibacterial tetracycline formulations: host-modulators in the treatment of periodontitis and relevant systemic diseases. International Dental Journal. 2016;66(3):127–135.
- Hadjimichael A.C., Foukas A.F., Savvidou O.D. et al. The anti-neoplastic effect of doxycycline in osteosarcoma as a metalloproteinase (MMP) inhibitor: a systematic review. Clin Sarcoma Res. 2020;30:10:7.
- Бабаскина А.И., Баева Е.С., Артюхов В.Г. Анализ воздействия некоторых солей доксициклина на структурное состояние эритроцитов и гемоглобина человека. Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2021;2:62–68.