Structural and functional features of donor blood hemoglobin in the presence of doxycycline and mexidol

Full Text

Использование лекарственных препаратов в практической медицине нередко сопровождается проявлением последними побочных эффектов различной этиологии. В последнее время появляется все большее количество работ, доказывающих негативное влияние терапевтических агентов на компоненты крови человека. Изменение кислородтранспортных и иных свойств эритроцитов – залог снижения адаптивных возможностей организма и, в конечном итоге, его функциональных резервов. Исследование взаимосвязи изменения структурно-функциональных свойств форменных элементов крови от присутствия модификаторов в инкубационной среде позволит выявить пути повышения их терапевтической эффективности и снизить вероятность проявления нежелательных эффектов.

В нормальной физиологии перекисное окисление липидов является важной составляющей частью системы регуляции. Однако, выходя за определенные пределы, процесс приобретает патогенетичекий характер, который проявляется денатурацией и инактивацией белка, делипидизацией мембраны, нарушением клеточного деления и роста клетки. Эти и другие действия контролируются антиоксидантной системой, которая играет важную роль в регуляции протекания свободно-радикальных превращений в организме, существенно влияя на его состояние. Поэтому антиоксиданты и исследование антиокислительных свойств различных соединений в последнее время получили широкое распространение.

Среди известных веществ, обладающих антиоксидантной защитой, обладает мексидол – 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат – мощный ингибитор процессов перекисного окисления липидов, нейтрализующий свободные радикалы, активирующий супероксиддисмутазу и глутатионпероксидазу [1]. В присутствии мексидола активизируется сукцинатоксидазный путь окисления, что на ранних стадиях гипоксии в условиях ограничения НАД-зависимого окисления позволяет сохранить в митохондриях определенный уровень окислительного фосфорилирования. Фармакологические эффекты мексидола реализуются на сосудистом и нейрональном уровнях, оказывая антигипоксантное, анксиолитическое, антистрессорное, нейропротективное, ноотропное и ряд других действий [1, 2].

Антибиотику тетрациклиновой группы – доксициклину (ДЦ) – по некоторым данным – присуще наличие так называемых неантибактериальных свойств, выражающихся не только во влиянии на иммунные реакции организма, но и белково-липидные компоненты его клеточных мембран [3, 4, 5], а также цитоархитектонику эритроцитов человека [6].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучить структурно-функциональные свойства гемоглобина, выделенного из эритроцитов донорской крови в условиях его предварительной инкубации модифицирующими агентами – мексидолом, доксициклином, нитритом натрия – по отдельности и в их сочетании.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Забор образцов крови (n = 20) осуществляли на Воронежской областной станции переливания в пробирки с гепарином натрия (Синтез, Россия) (+4 °С). В основе расчета концентрации модификаторов – разовая доза препаратов (8,75 × 10^-7 мкг/мл ДЦ, 4,47 × 10^-6 мкг/мл мексидола). Навеску ДЦ гидрохлорида (Sigma Aldrich), как и мексидола (Фармасофт), растворяли в заданном объеме 0,9%-го раствора NaCl. В цельную кровь объемом 150 мкл добавляли совместно или по отдельности препараты, осторожно перемешивали и хранили в холодильнике при температуре +4 °С в течение 60 мин для антибиотика и 10 мин для нитрита натрия и мексидола. В общей сумме получали 10 образцов с различными комплексами «цельная кровь – модифицирующие агенты» (табл.).

 

Последовательность введения модификаторов в растворы оксигемоглобина человека (цифрами в скобках указан порядок использования раствора)

Пробирка	Кровь, мкл	Раствор ДЦ, мкл	Раствор мексидола, мкл	Раствор NaNO2, мкл	NaCl (0.9 %) мкл
1	150	–	–	–	20
2	150	–	–	10	10
3	150	–	10 (2)	10 (1)	–
4	150	10 (2)	–	10 (1)	–
5	150	–	10	–	10
6	150	–	10 (1)	10 (2)	–
7	150	10 (2)	10 (1)	–	–
8	150	10	–	–	10
9	150	10 (1)	–	10 (2)	–
10	150	10 (1)	10 (2)	–	–

 

Для получения растворов гемоглобина цельную донорскую кровь с модифицирующими агентами промывали изотоническим раствором NaCl, центрифугировали в течение 5 минут со скоростью 3000 об./мин на центрифуге MiniSpin. К осадку эритроцитов в качестве гемолизирующего агента добавляли дистиллированную воду, клетки осаждали в течение 10 мин при 12 000 об./мин. Полученный раствор гемоглобина доводили до оптической плотности D ~ 0,8. Регистрацию электронных спектров поглощения растворов нативного и модифицированного гемоглобина проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-401PC в диапазоне длин волн от 200 до 750 нм (через 1 нм). Статистическую обработку данных проводили с помощью прикладных пакетов Microsoft Excel. Концентрации лигандных форм гемоглобина определяли, используя величины изменения спектральных характеристик и эмпирических формул [3, 4].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Методом спектрофотометрии проведена регистрация спектральных характеристик исследуемых модификаторов (рис. 1).

Как следует из представленных данных, мексидол характеризуется наличием четко различимых пиков в области 200, 295 нм, а ДЦ – при 272 и 345 нм. Установлено, что молекулы мексидола не вызывают значительных изменений в молекуле гемоглобина человека (рис. 2).

 

Рис. 1. Спектры поглощения растворов мексидола и доксициклина гидрохлорида

 

Рис. 2. Спектры поглощения растворов оксигемоглобина в присутствии мексидола и доксициклина гидрохлорида

 

В то же время сочетанное его использование с ДЦ способствует перераспределению электронной плотности в белковой области спектра, что может быть объяснено комплексированием модификаторов с молекулами гембелка. Последовательное введение в раствор мексидола и ДЦ, либо ДЦ и мексидола вызывает изменения спектральных свойств, проявляющиеся при длинах волн λ = 272 нм и 342 нм. Исходя из этого, можно отметить, что белковая часть гемоглобина может изменять свои структурно-функциональные особенности и расположение гемового кармана. Введение в среду нитрита натрия способствует окислению гемоглобина, что подтверждается высокой интенсивностью полос поглощения при 408 и 630 нм (рис. 3).

Обращает на себя внимание тот факт, что при взаимодействии модифицированной ДЦ крови с нитритом натрия выявляется наименьшая степень окисления железа (38,4 %) по сравнению с другими исследованными образцами.

На основании исследования спектральных характеристик растворов оксигемоглобина человека, модифицированных ДЦ, мексидолом и нитритом натрия, установлено изменение соотношения лигандных форм гемопротеида в растворе (рис. 4).

 

Рис 3. Спектры поглощения растворов гемоглобина в присутствии модификаторов: 1 – контроль (нормальный спектр); 2 – HbO₂+NaNO₂, 3 – HbO₂+ NaNO₂+Мексидол, 4 – HbO₂+ NaNO₂+ ДЦ (р < 0,05)

 

Рис. 4. Соотношение лигандных форм гемоглобина в растворе: ДЦ – доксициклин, М – мексидол (р < 0,05)

 

Следовательно, последовательность введения модификаторов в растворы гемоглобина оказывает прямое влияние на структурно-функциональное состояние последнего, а следовательно, и на его способность связывать и удерживать кислород. Полученные данные доказывают факт взаимодействия ДЦ с белково-липидными компонентами гемоглобина человека, проявляющийся в перераспределении электронной плотности в молекулах гембелка. По-видимому, наименьший уровень образования метгемоглобина (41,3%) достигнут в результате конкурентного связывания нитрит-ионов с гемовым карманом гембелка в сравнении с другими растворами, содержащими нитрит натрия (47,4 %, 53,4 %). Таким образом, ДЦ может оказывать защитный эффект от окислителей, таких как нитрит натрия, что требует продолжения исследований в данной области.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Индуцированное модификаторами изменение спектральных свойств оксигемоглобина, по-видимому, является отражением волны конформационных изменений на уровне гема и глобина, что сопровождается частичным отрывом лиганда (О₂) от молекулы белка. На клеточном уровне подобные процессы могут найти отражение в изменении кислородтранспортной способности эритроцитов (их частичная деоксигенация), а повышенное сродство ДЦ к молекулам гемопротеида, обнаруженное в наших модельных системах, потенциально затронет состояние белково-липидных компонентов клеток крови.

About the authors

Elena S. Baeva

Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko

Author for correspondence.
Email: galaxy1985@mail.ru

Candidate of Biological Sciences, Associate Professor of the Department of Normal Physiology

Russian Federation, Voronezh

Elena S. Artyukhov

Voronezh State University

Email: artyukhov@bio.vsu.ru

Doctor of Biological Sciences, Professor, Head of the Department of Biophysics and Biotechnology

Russian Federation, Voronezh

Olga S. Kurkina

Voronezh State University

Email: kuurochka@gmail.com

Master of the Department of Biophysics and Biotechnology

Russian Federation, Voronezh

References

Supplementary files