Эндотелиальная дистрофия Фукса: патогенетические особенности заболевания

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Эндотелиальная дистрофия (ЭД) Фукса – мультигенное двустороннее заболевание, проявляющееся дисфункцией эндотелия, появлением гутт на эндотелиальной поверхности десцеметовой мембраны (ДМ) и снижением прозрачности роговицы. Цель. Изучить особенности патогенеза ЭД Фукса на основе гистологического, иммуногистохимического (ИГХ) и иммунофлуоресцентного методов, сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Методы. Образцы ДМ и эндотелия (ДМ-Э) и полнослойной роговицы, полученные у 76 пациентов (85 глаз) с ЭД Фукса, разделены на 1А, 2А, 3А группы, 15 образцов ДМ-Э (донорская ткань) – на 1Б, 2Б, 3Б группы. Проводили окрашивание гематоксилином и эозином, ИГХ анализ экспрессии цитокератина АЕ1/АЕ3 и виментина (1А, 1Б группы), фазово-контрастную микроскопию и иммунофлуоресцентное исследование экспрессии белков плотных межклеточных контактов, ZO-1 (2А, 2Б группы), СЭМ (3А, 3Б группы). Результаты. При ЭД Фукса число ЭК снижено, компенсаторно увеличены площадь ЭК и их ядер, ядерно-цитоплазматическое соотношение не отличается между группами. Продукция ZO-1 в ЭК снижена, преимущественно в зоне роста гутт. Отмечена коэкспрессия цитокератина АЕ1/АЕ3 и виментина. Толщина ДМ при ЭД Фукса (19,04 ± 4,13) мкм, в контроле (10,5 ± 0,41) мкм (p < 0,01). Отмечены отек и очаги фиброза в строме и эпителии, экспрессия виментина (клетки стромы) и цитокератина АЕ1/АЕ3 (эпителиальные клетки) при ЭД Фукса. Заключение. Патогенез ЭД Фукса включает в себя постепенную эпителиально-мезенхимальную трансформацию ЭК, сопровождающуюся синтезом гутт, деформирующих цитоскелет ЭК и приводящих к уменьшению числа функционально активных ЭК. В результате возникает изменение проницаемости эндотелиального слоя с развитием отека и фиброза стромы и эпителия роговицы.

Полный текст

Как известно, дистрофии роговицы – это группа двусторонних генетически детерминированных заболеваний, характеризующихся различной степенью пенетрантности и экспрессивности. Так, эндотелиальная дистрофия (ЭД) Фукса впервые была описана E. Fuchs в 1910 г. у 13 пациентов как хронический отек поверхностных слоев роговицы с медленно прогрессирующим течением [1]. В последующие годы было установлено, что причиной развития данного патологического состояния является необратимое постепенное снижение количества эндотелиальных клеток (ЭК) роговицы в сочетании с появлением каплевидных образований (гутт) на эндотелиальной поверхности десцеметовой мембраны (ДМ). В условиях дефицита ЭК, уменьшения их метаболической активности и нарушения целостности межклеточных контактов возникает дисфункция эндотелиального слоя. Прогрессирование данного состояния приводит к повышению проницаемости стромы роговицы для влаги передней камеры глаза с развитием отека и буллезными изменениями эпителиального слоя [2, 3]. Вместе с тем, в доступной литературе существуют немногочисленные данные комплексного структурного анализа образцов роговицы при ЭД Фукса, удаленных во время кератопластики с использованием различных методов исследования [4, 5, 6].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучить особенности патогенеза эндотелиальной дистрофии Фукса на основе гистологического, иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного методов, а также сканирующей электронной микроскопии.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование были включены 76 пациентов (85 глаз) с клиническим диагнозом ЭД Фукса, которым проводили стандартное офтальмологическое обследование и оптическую когерентную томографию (ОКТ) роговицы (RTvue-100, Optovue, США). Снижение прозрачности стромы и эпителия вследствие отека и буллезных изменений (по данным биомикроскопии и ОКТ) было показанием к выполнению эндотелиальной кератопластики (трансплантация ДМ или задняя автоматизированная кератопластика). Во время операции в каждом случае проводили забор образцов роговичной ткани (комплекс ДМ и эндотелия – ДМ-Э). В случае наличия участков стромы высокой оптической плотности и неоваскуляризации проводили сквозную кератопластику, при которой получали биоптаты полнослойной роговицы.

В зависимости от метода структурного анализа все образцы роговичной ткани были разделены на 3 группы: 1А, 2А, 3А. В качестве контроля (группы 1Б, 2Б, 3Б) использовали 15 комплексов ДМ-Э, выделенных из донорских корнеосклеральных дисков [срок хранения в консервационной среде Борзенка-Мороз (2 ± 1) сут., глазной тканевой банк ФГБНУ «НИИ глазных болезней имени М.М. Краснова»] (см. табл.).

 

Характеристика методов и материала исследования

Методы

Гистологическое, иммуногистохимическое исследование

(световая микроскопия – светлое поле)

Фазово-контрастная микроскопия, иммунофлуоресцентное исследование (световая микроскопия – флуоресценция, фазовый контраст)

Сканирующая электронная микроскопия

Группы

ДМ-Э /полнослойная роговица

51/9

7/0

21/0

6/0

4/0

2/0

Количество пациентов (глаз)

53 (60)1

7

20 (21)2

6

4 (4)

2

Пол (м/ж)

20/33

3/4

7/13

3/3

1/3

1/1

Возраст, лет (M ± SD)

72,32 ± 9,91

61,14 ± 7,54

69,3 ± 8,67

62,0 ± 10,24

67,25 ± 6,7

49,0 и 54,0

1 Комплексы ДМ-Э 4 пациентов, полученные в каждом случае при кератопластике на контралатеральном глазу, включены в 2А группу.

2 Комплекс ДМ-Э, полученный у 1 пациента, при кератопластике на контрлатеральном глазу, включен в 3А группу.

 

Гистологические и иммуногистохимические методы. Образцы ДМ-Э (1А и 1Б группы) и полнослойной роговичной ткани (1А группа) фиксировали в 10%-м нейтральном растворе формалина с фосфатным буфером, изготавливали парафиновые блоки и срезы. 3–4 среза каждого образца окрашивали гематоксилином и эозином, 9 срезов использовали для иммуногистохимического (ИГХ) исследования. ИГХ-реакции выполняли по стандартным протоколам с использованием первичных моноклональных антител к цитокератину AE1/AE3 (Cytokeratin AE1/AE3, Dako Inc., Дания, 1:200) и виментину (V9, Dako Inc., Дания, 1:200). ИГХ-реакцию считали положительной при темно-коричневом окрашивании цитоплазмы клеток. Визуализацию осуществляли микроскопом Leica DM-2500 с фотокамерой Leica DFC 295 и программным обеспечением Leica Application Suite V4.8 (Leica Microsystems, Швейцария). Морфометрический анализ ДМ комплексов ДМ-Э и полнослойных роговиц включал в себя определение среднего значения ее толщины, измеренной в 3 зонах (дистанция 5 мкм) каждого среза, окрашенного гематоксилином и эозином.

Фазово-контрастная микроскопия и иммунофлуоресцентное исследование. Образцы комплексов ДМ-Э (2А и 2Б группы) фиксировали в 10%-м нейтральном растворе формалина с фосфатным буфером. После пермеабилизации и блокировки неспецифического связывания проводили реакцию с первичными антителами к белку плотных межклеточных контактов zonula occludens-1 (ZO-1, Thermo Fisher Scientific, США, 1 : 100). Вторичные антитела были конъюгированы с меткой Alexa Fluor 594 (Thermo Fisher Scientific, США, 1 : 750). Ядра ЭК докрашивали Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific, США, 1мкг/мл). Визуализацию выполняли на микроскопе Leica DM-2500 с фотокамерой Leica DFC 295 (Leica Microsystems, Швейцария) в режимах детекции флуоресценции и фазового контраста. На 5-6 изображениях (размер 173,52 × 128,81 мкм) каждого плоскостного препарата ДМ-Э определяли количество и площадь клеток, а также их ядер в программе ImageJ (США), после чего вычисляли ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО).

Метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Образцы комплексов ДМ-Э (3А и 3Б группы) последовательно контрастировали по протоколу производителя хлоридом неодима и ацетатом свинца (BioREE-B, Глаукон, Россия). Полученные образцы исследовали на сканирующем электронном микроскопе Zeiss EVO LS10 (Zeiss, Германия) в режиме низкого вакуума (70 Па), ускоряющего напряжения 20–25 кВ, токе зонда 126–320 пА, с использованием детектора обратно-рассеянных электронов (BSE).

Статистический анализ данных осуществляли с использованием программы SPSS 26 (IBM, США). При нормальном распределении количественные переменные были представлены в виде среднего арифметического (M) и стандартного отклонения (SD). Статистически значимыми различия между двумя независимыми выборками считали при p < 0,05 (Т-критерий Стьюдента).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Гистологическое и иммуногистохимическое исследование. Во всех образцах 1А группы обнаружена умеренная экспрессия цитокератина AE1/AE3 (маркера эпителиальных клеток) в ЭК (рис. 1а). При этом в отдельных случаях отмечена умеренная коэкспрессия виментина, что свидетельствует о переходе фенотипа ЭК в фибробластоподобный (рис. 1б). Сходные результаты были получены Hidayat A.A. и соавт. [7], а проведенные исследования показали, что постепенная эпителиально-мезенхимальная трансформация ЭК при ЭД Фукса вызывает продукцию ими компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ), которые накапливаются на поверхности ДМ [6, 8, 9]. Так, во всех образцах 1А группы отмечена волнистая эндотелиальная поверхность ДМ с гуттами. Морфометрический анализ толщины ДМ в обеих группах показал ее увеличение при ЭД Фукса, (19,04 ± 4,13) мкм, по сравнению с контролем (10,5 ± 0,41) мкм, p < 0,01 (рис. 1в, г). В задних отделах стромы полнослойных роговиц 1А группы обнаружены плотно организованный ВКМ, единичные кератоциты и сосуды. В некоторых образцах подобные изменения распространяются в вышележащие отделы. Однако наиболее часто ВКМ средней и передней стромы имеет рыхлое волокнистое строение, с новообразованными сосудами и выраженной клеточной (кератоциты, макрофаги, лимфоциты) инфильтрацией, которая практически не определяется под боуменовой мембраной. Высокий уровень экспрессии виментина отмечен в кератоцитах, лимфоцитах, макрофагах и эндотелии новообразованных сосудов – клетках мезенхимального происхождения (рис. 1д). На всех срезах (окраска гематоксилином и эозином) выявлены зоны деформации или разрыва боуменовой мембраны. Эпителиальный слой неравномерный с интраэпителиальными кистами и плотной соединительной тканью, а также локальным отсутствием клеток на базальной мембране. Кроме того, обнаружены дистрофические изменения клеток и выраженная экспрессия цитокератина AE1/AE3 (рис. 1е).

Таким образом, изменения стромы и эпителия полнослойных роговиц, включенных в 1А группу, свидетельствуют о разных стадиях хронического локального воспалительного процесса: отеке, неоваскуляризации и ремоделировании ткани с исходом в фиброз – что подтверждает результаты ранее проведенных исследований [3].

Иммунофлуоресцентное исследование. Сравни-тельный анализ состояния эндотелиального слоя образцов ДМ-Э 2А и 2Б групп выявил уменьшение количества клеток, синтезирующих белок ZO-1, при ЭД Фукса, по сравнению с контролем (рис. 2а, б). В связи с тем, что визуализация некоторых клеток была затруднена, их количество определяли как среднее значение абсолютного числа ядер в каждом из изображений исследуемого образца. В результате было установлено, что в комплексах ДМ-Э, включенных во 2А группу, количество ЭК снижено (27,19 ± 12,77), по сравнению с контролем (50,82 ± 10,73). Площадь клеток ДМ-Э при ЭД Фукса составляет (490,99 ± 146,12) мкм2 и достоверно превышает аналогичный показатель в образцах 2Б группы, (343,69 ± 85,14) мкм2. Подобные изменения подтверждают описанный ранее феномен «распластывания» ЭК при их дефиците и слабой пролиферации in vivo [10]. Кроме того, механическая деформация клеточных мембран и цитоскелета, а также разрушение межклеточных контактов вызваны прогрессирующим ростом гутт в направлении от ДМ к ЭК. Так, при световой микроскопии в образцах ДМ-Э 2А группы визуализируются ядра вытянутой формы, смещенные к периферии ЭК (рис. 2а). Кроме того, обнаружено достоверное увеличение их площади (55,14 ± 19,02) мкм2, по сравнению с контролем (31,51 ± 13,02) мкм2. Вместе с тем, ЯЦО – показатель морфо-функционального состояния ЭК – не отличается в образцах 2А и 2Б групп, (0,14 ± 0,05) и (0,12 ± 0,04) соответственно, p = 0,329.

 

Рис. 1. Роговица при эндотелиальной дистрофии Фукса (ЭД Фукса) и в норме: а – цитокератин AE1/AE3 в эндотелиальных клетках (ЭК) при ЭД Фукса, ×200; б – виментин в ЭК при ЭД Фукса, ×400; в – десцеметова мембрана и ЭК при ЭД Фукса, ×100, гематоксилин и эозин, ЭК (белая стрелка), гутты (черная стрелка); г – десцеметова мембрана и ЭК в норме, ×100, гематоксилин и эозин, ЭК (белая стрелка); д – виментин в клетках стромы при ЭД Фукса, ×200; е – цитокератин AE1/AE3 в эпителиальных клетках при ЭД Фукса, ×200

 

Рис. 2. Эндотелий и десцеметова мембрана при эндотелиальной дистрофии Фукса (а) и в норме (б). Съемка в режиме детекции флуоресценции (белки межклеточных контактов ZO-1 окрашены в красный цвет, ядра – в синий цвет) и фазового контраста (гутты отмечены белыми стрелками); ×630

 

Таким образом, выявленные изменения морфометрических параметров ЭК подтверждают, что снижение прозрачности роговицы при ЭД Фукса обусловлено патологическими изменениями эндотелиального слоя, возникающими, в том числе, на фоне прогрессирующего роста гутт. Вместе с тем, отсутствие отклонения ЯЦО от показателей контроля, свидетельствует о том, что данные ЭК находятся в состоянии относительной компенсации и сохраняют функциональную активность. Представленные результаты иммунофлуоресцентного исследования коррелирует с тем, что все образцы ДМ-Э, включенные во 2А группу, были получены при эндотелиальной кератопластике у пациентов с ЭД Фукса без клинических признаков фиброза стромы.

Сканирующая электронная микроскопия. На изображениях образцов ДМ-Э 3А и 3Б групп был проведен сравнительный анализ пространственного расположения ЭК относительно друг друга и окружающих структур (рис. 3а–в). Так, в норме (3Б группа) полигональные ЭК с яркими ядрами округлой формы образуют монослой на поверхности ДМ (рис. 3в). При ЭД Фукса на изображениях ДМ-Э визуализируется иррегулярный пласт измененных ЭК и округлые образования ВКМ – гутты. Выявлена патологическая взаимосвязь между расположением этих структур. Так, гутты проминируют кпереди, приводя к деформации и выраженному полиморфизму ЭК (рис. 3а). На большем увеличении видно, что некоторые ЭК увеличены, их цитоплазматические мембраны истончены и расположены над гуттой, которая представляет собой плотноорганизованную структуру (рис. 3б).

 

Рис. 3. Изображение эндотелиальных клеток (ЭК) и десцеметовой мембраны при эндотелиальной дистрофии Фукса (ЭД Фукса) и в норме. Сьемка методом сканирующей электронной микроскопии в режиме BSE (а, б – десцеметова мембрана и ЭК при ЭД Фукса: цитоплазматическая мембрана ЭК (оранжевые, зеленые, желтые стрелки), ядро (синяя стрелка), гутта (красная звездочка); в – десцеметова мембрана и ЭК в норме: цитоплазматическая мембрана ЭК (оранжевая стрелка), ядро (синяя стрелка), десцеметова мембрана (зеленая звездочка).

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, патогенез ЭД Фукса включает в себя постепенную эпителиально-мезенхимальную трансформацию ЭК, сопровождающуюся синтезом ВКМ – гутт, неуклонный рост которых деформирует цитоскелет ЭК. В результате нарушения межклеточных взаимодействий и уменьшения количества функционально активных ЭК возникает изменение проницаемости эндотелиального слоя с развитием хронического отека стромы и эпителия роговицы. В связи с этим патогенетически обусловленным способом восстановления прозрачности роговицы является эндотелиальная кератопластика с селективным замещением измененного комплекса ДМ-Э. Длительное течение ЭД Фукса, как правило, характеризуется критическим снижением числа функционально активных ЭК, переходом отека стромы в фиброз. Подобное состояние является показанием к проведению сквозной кератопластики, то есть замещению полнослойной роговицы аналогичной донорской тканью.

×

Об авторах

Наталья Владимировна Фисенко

Научно-исследовательский институт глазных болезней имени М.М. Краснова

Email: natfisenko@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7198-4498
Scopus Author ID: 57192992418

Кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник 

Россия, Москва

Юсеф Наим Юсеф

Научно-исследовательский институт глазных болезней имени М.М. Краснова"

Email: info@eyeacademy.ru
ORCID iD: 0000-0003-4043-456X
Scopus Author ID: 57192982029

доктор медицинских наук, профессор, директор

Россия, Москва

Татьяна Александровна Демура

Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: demura-t@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6946-6146
Scopus Author ID: 25936132400

доктор медицинских наук, директор Института клинической морфологии и цифровой патологии

Россия, Москва

Анастасия Михайловна Суббот

Научно-исследовательский институт глазных болезней имени М.М. Краснова

Email: kletkagb@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8258-6011
Scopus Author ID: 55266556100

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник

Россия, Москва

Иван Александрович Новиков

Научно-исследовательский институт глазных болезней имени М.М. Краснова

Email: i.novikov@niigb.ru
ORCID iD: 0000-0003-4898-4662
Scopus Author ID: 25951426100

Старший научный сотрудник 

Россия, Москва

Григорий Альбертович Осипян

Научно-исследовательский институт глазных болезней имени М.М. Краснова

Автор, ответственный за переписку.
Email: gregor79@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1056-4331
Scopus Author ID: 57200247282

Доктор медицинских наук, заведующий отделом патологии оптических сред глаза

Россия, Москва

Список литературы

  1. Fuchs E. Dystrophia epithelialis corneae. Graefes Arhiv für Ophthalmologie. 1910;76:478–508. doi: 10.1007/BF01986362.
  2. Matthaei M., Hribek A., Clahsen T. et al. Fuchs endothelial corneal dystrophy: clinical, genetic, pathophysiologic, and therapeutic aspects. Annu Rev Vis Sci. 2019;5:151–175. doi: 10.1146/annurev-vision-091718-014852.
  3. Ong Tone S., Kocaba V., Böhm M. et al. Fuchs endothelial corneal dystrophy: The vicious cycle of Fuchs pathogenesis. Prog Retin Eye Res. 2021;80:100863. doi: 10.1016/j.preteyeres.2020.100863.
  4. Brockmann T., Brockmann C., Maier A.B. et al. Primary Descemet’s membrane endothelial keratoplasty for Fuchs endothelial dystrophy versus bullous keratopathy: histopathology and clinical results. Curr Eye Res. 2018;43(10):1221–1227. doi: 10.1080/02713683.2018.1490773
  5. De Roo A.K., Janssens T., Foets B., van den Oord J.J. Immunohistochemical Profiling of Corneas With Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy. Cornea. 2017;36(7):866–874. doi: 10.1097/ICO.0000000000001212.
  6. Okumura N., Minamiyama R., Ho L. et al. Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy. Laboratory Investigation. 2015;95:1291–1304.
  7. Hidayat A.A., Cockerham G.C. Epithelial metaplasia of the corneal endothelium in Fuchs endothelial dystrophy. Cornea. 2006;25(8):956–959. doi: 10.1097/01.ico.0000228786.84581.ee.
  8. Xia D., Zhang S., Nielsen E. et al. The Ultrastructures and Mechanical Properties of the Descement’s Membrane in Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy. Sci Rep. 2016;6:23096. doi: 10.1038/srep23096.
  9. Weller J.M., Zenkel M., Schlötzer-Schrehardt U. et al. Extracellular matrix alterations in late-onset Fuchs’ corneal dystrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014;55(6):3700–3708. doi: 10.1167/iovs.14-14154.
  10. Joyce N.C. Proliferative capacity of the corneal endothelium. Prog Retin Eye Res. 2003;22(3):359–389. doi: 10.1016/s1350-9462(02)00065-4.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
2. Рис. 1. Роговица при эндотелиальной дистрофии Фукса (ЭД Фукса) и в норме: а – цитокератин AE1/AE3 в эндотелиальных клетках (ЭК) при ЭД Фукса, ×200; б – виментин в ЭК при ЭД Фукса, ×400; в – десцеметова мембрана и ЭК при ЭД Фукса, ×100, гематоксилин и эозин, ЭК (белая стрелка), гутты (черная стрелка); г – десцеметова мембрана и ЭК в норме, ×100, гематоксилин и эозин, ЭК (белая стрелка); д – виментин в клетках стромы при ЭД Фукса, ×200; е – цитокератин AE1/AE3 в эпителиальных клетках при ЭД Фукса, ×200

3. Рис. 2. Эндотелий и десцеметова мембрана при эндотелиальной дистрофии Фукса (а) и в норме (б). Съемка в режиме детекции флуоресценции (белки межклеточных контактов ZO-1 окрашены в красный цвет, ядра – в синий цвет) и фазового контраста (гутты отмечены белыми стрелками); ×630

Скачать (637KB)
4. Рис. 3. Изображение эндотелиальных клеток (ЭК) и десцеметовой мембраны при эндотелиальной дистрофии Фукса (ЭД Фукса) и в норме. Сьемка методом сканирующей электронной микроскопии в режиме BSE (а, б – десцеметова мембрана и ЭК при ЭД Фукса: цитоплазматическая мембрана ЭК (оранжевые, зеленые, желтые стрелки), ядро (синяя стрелка), гутта (красная звездочка); в – десцеметова мембрана и ЭК в норме: цитоплазматическая мембрана ЭК (оранжевая стрелка), ядро (синяя стрелка), десцеметова мембрана (зеленая звездочка).

Скачать (554KB)

© Фисенко Н.В., Юсеф Ю.Н., Демура Т.А., Суббот А.М., Новиков И.А., Осипян Г.А., 2024

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 79562 от 27.11.2020 г.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах