Fuchs endothelial corneal dystrophy: aspects of pathogenesis
- 作者: Fisenko N.V.1, Yusef Y.N.1, Demura T.A.2, Subbot A.M.1, Novikov I.A.1, Osipyan G.A.3,1
-
隶属关系:
- M.M. Krasnov Scientific Research Institute of Eye Diseases
- I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)
- 期: 卷 21, 编号 2 (2024)
- 页面: 73-78
- 栏目: Original Researches
- URL: https://journals.eco-vector.com/1994-9480/article/view/628951
- DOI: https://doi.org/10.19163/1994-9480-2024-21-2-73-78
- ID: 628951
如何引用文章
全文:
详细
Fuchs endothelial corneal dystrophy (FECD) – multigenic bilateral disorder, characterized by dysfunction of corneal endothelium cells (CECs) that eventually results in loss of transparency. Purpose: To evaluate the pathogenesis of FECD with histological and immunohistochemical methods, immunofluorescence, scanning electron microscopy (SEM). Methods: Endothelium–Descemet membrane (EDM) complexes, corneal buttons were obtained from 76 patients (85 eyes) with FECD during keratoplasty and divided into 1A, 2A, 3A groups, 15 EDMs (donor tisuue) – 1B, 2B, 3B groups (control). Morphological (hematoxylin/eosin staining) and immunohistochemical (primary antibodies to cytokeratin AE1/AE3 and vimentin) studies (1A, 1B groups), phase-contrast microscopy and immunofluorescence analysis of tight junction protein ZO-1 (2A, 2B groups), SEM (3A, 3B groups) were performed. Results: FECD is characterized by decline of CECs, cell and nuclear enlargement. Nuclear-cytoplasmic ratio of CECs is relative to control. CECs expression ZO-1 is decreased in the area of guttae ingrowth. Coexpression of cytokeratin AE1/AE3 and vimentin is found. Morphological and immunohistochemical studies show DM’ thickening, stromal and epithelial edema and local fibrosis, vimentin (stromal cells) and cytokeratin AE1/AE3 (epithelium) expression in FECD. Conclusion: Pathogenesis of FECD include CECs’ epithelial-mesenchymal transition, followed by guttae formation – the excrescences, which destroy cytosketon and lead to progressive loss of CECs. Changes in permeability of endothelium cause edema and fibrosis of stroma and epithelial layer.
全文:
Как известно, дистрофии роговицы – это группа двусторонних генетически детерминированных заболеваний, характеризующихся различной степенью пенетрантности и экспрессивности. Так, эндотелиальная дистрофия (ЭД) Фукса впервые была описана E. Fuchs в 1910 г. у 13 пациентов как хронический отек поверхностных слоев роговицы с медленно прогрессирующим течением [1]. В последующие годы было установлено, что причиной развития данного патологического состояния является необратимое постепенное снижение количества эндотелиальных клеток (ЭК) роговицы в сочетании с появлением каплевидных образований (гутт) на эндотелиальной поверхности десцеметовой мембраны (ДМ). В условиях дефицита ЭК, уменьшения их метаболической активности и нарушения целостности межклеточных контактов возникает дисфункция эндотелиального слоя. Прогрессирование данного состояния приводит к повышению проницаемости стромы роговицы для влаги передней камеры глаза с развитием отека и буллезными изменениями эпителиального слоя [2, 3]. Вместе с тем, в доступной литературе существуют немногочисленные данные комплексного структурного анализа образцов роговицы при ЭД Фукса, удаленных во время кератопластики с использованием различных методов исследования [4, 5, 6].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить особенности патогенеза эндотелиальной дистрофии Фукса на основе гистологического, иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного методов, а также сканирующей электронной микроскопии.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В исследование были включены 76 пациентов (85 глаз) с клиническим диагнозом ЭД Фукса, которым проводили стандартное офтальмологическое обследование и оптическую когерентную томографию (ОКТ) роговицы (RTvue-100, Optovue, США). Снижение прозрачности стромы и эпителия вследствие отека и буллезных изменений (по данным биомикроскопии и ОКТ) было показанием к выполнению эндотелиальной кератопластики (трансплантация ДМ или задняя автоматизированная кератопластика). Во время операции в каждом случае проводили забор образцов роговичной ткани (комплекс ДМ и эндотелия – ДМ-Э). В случае наличия участков стромы высокой оптической плотности и неоваскуляризации проводили сквозную кератопластику, при которой получали биоптаты полнослойной роговицы.
В зависимости от метода структурного анализа все образцы роговичной ткани были разделены на 3 группы: 1А, 2А, 3А. В качестве контроля (группы 1Б, 2Б, 3Б) использовали 15 комплексов ДМ-Э, выделенных из донорских корнеосклеральных дисков [срок хранения в консервационной среде Борзенка-Мороз (2 ± 1) сут., глазной тканевой банк ФГБНУ «НИИ глазных болезней имени М.М. Краснова»] (см. табл.).
Характеристика методов и материала исследования
Методы | Гистологическое, иммуногистохимическое исследование (световая микроскопия – светлое поле) | Фазово-контрастная микроскопия, иммунофлуоресцентное исследование (световая микроскопия – флуоресценция, фазовый контраст) | Сканирующая электронная микроскопия | |||
Группы | 1А | 1Б | 2А | 2Б | 3А | 3Б |
ДМ-Э /полнослойная роговица | 51/9 | 7/0 | 21/0 | 6/0 | 4/0 | 2/0 |
Количество пациентов (глаз) | 53 (60)1 | 7 | 20 (21)2 | 6 | 4 (4) | 2 |
Пол (м/ж) | 20/33 | 3/4 | 7/13 | 3/3 | 1/3 | 1/1 |
Возраст, лет (M ± SD) | 72,32 ± 9,91 | 61,14 ± 7,54 | 69,3 ± 8,67 | 62,0 ± 10,24 | 67,25 ± 6,7 | 49,0 и 54,0 |
1 Комплексы ДМ-Э 4 пациентов, полученные в каждом случае при кератопластике на контралатеральном глазу, включены в 2А группу.
2 Комплекс ДМ-Э, полученный у 1 пациента, при кератопластике на контрлатеральном глазу, включен в 3А группу.
Гистологические и иммуногистохимические методы. Образцы ДМ-Э (1А и 1Б группы) и полнослойной роговичной ткани (1А группа) фиксировали в 10%-м нейтральном растворе формалина с фосфатным буфером, изготавливали парафиновые блоки и срезы. 3–4 среза каждого образца окрашивали гематоксилином и эозином, 9 срезов использовали для иммуногистохимического (ИГХ) исследования. ИГХ-реакции выполняли по стандартным протоколам с использованием первичных моноклональных антител к цитокератину AE1/AE3 (Cytokeratin AE1/AE3, Dako Inc., Дания, 1:200) и виментину (V9, Dako Inc., Дания, 1:200). ИГХ-реакцию считали положительной при темно-коричневом окрашивании цитоплазмы клеток. Визуализацию осуществляли микроскопом Leica DM-2500 с фотокамерой Leica DFC 295 и программным обеспечением Leica Application Suite V4.8 (Leica Microsystems, Швейцария). Морфометрический анализ ДМ комплексов ДМ-Э и полнослойных роговиц включал в себя определение среднего значения ее толщины, измеренной в 3 зонах (дистанция 5 мкм) каждого среза, окрашенного гематоксилином и эозином.
Фазово-контрастная микроскопия и иммунофлуоресцентное исследование. Образцы комплексов ДМ-Э (2А и 2Б группы) фиксировали в 10%-м нейтральном растворе формалина с фосфатным буфером. После пермеабилизации и блокировки неспецифического связывания проводили реакцию с первичными антителами к белку плотных межклеточных контактов zonula occludens-1 (ZO-1, Thermo Fisher Scientific, США, 1 : 100). Вторичные антитела были конъюгированы с меткой Alexa Fluor 594 (Thermo Fisher Scientific, США, 1 : 750). Ядра ЭК докрашивали Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific, США, 1мкг/мл). Визуализацию выполняли на микроскопе Leica DM-2500 с фотокамерой Leica DFC 295 (Leica Microsystems, Швейцария) в режимах детекции флуоресценции и фазового контраста. На 5-6 изображениях (размер 173,52 × 128,81 мкм) каждого плоскостного препарата ДМ-Э определяли количество и площадь клеток, а также их ядер в программе ImageJ (США), после чего вычисляли ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО).
Метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Образцы комплексов ДМ-Э (3А и 3Б группы) последовательно контрастировали по протоколу производителя хлоридом неодима и ацетатом свинца (BioREE-B, Глаукон, Россия). Полученные образцы исследовали на сканирующем электронном микроскопе Zeiss EVO LS10 (Zeiss, Германия) в режиме низкого вакуума (70 Па), ускоряющего напряжения 20–25 кВ, токе зонда 126–320 пА, с использованием детектора обратно-рассеянных электронов (BSE).
Статистический анализ данных осуществляли с использованием программы SPSS 26 (IBM, США). При нормальном распределении количественные переменные были представлены в виде среднего арифметического (M) и стандартного отклонения (SD). Статистически значимыми различия между двумя независимыми выборками считали при p < 0,05 (Т-критерий Стьюдента).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Гистологическое и иммуногистохимическое исследование. Во всех образцах 1А группы обнаружена умеренная экспрессия цитокератина AE1/AE3 (маркера эпителиальных клеток) в ЭК (рис. 1а). При этом в отдельных случаях отмечена умеренная коэкспрессия виментина, что свидетельствует о переходе фенотипа ЭК в фибробластоподобный (рис. 1б). Сходные результаты были получены Hidayat A.A. и соавт. [7], а проведенные исследования показали, что постепенная эпителиально-мезенхимальная трансформация ЭК при ЭД Фукса вызывает продукцию ими компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ), которые накапливаются на поверхности ДМ [6, 8, 9]. Так, во всех образцах 1А группы отмечена волнистая эндотелиальная поверхность ДМ с гуттами. Морфометрический анализ толщины ДМ в обеих группах показал ее увеличение при ЭД Фукса, (19,04 ± 4,13) мкм, по сравнению с контролем (10,5 ± 0,41) мкм, p < 0,01 (рис. 1в, г). В задних отделах стромы полнослойных роговиц 1А группы обнаружены плотно организованный ВКМ, единичные кератоциты и сосуды. В некоторых образцах подобные изменения распространяются в вышележащие отделы. Однако наиболее часто ВКМ средней и передней стромы имеет рыхлое волокнистое строение, с новообразованными сосудами и выраженной клеточной (кератоциты, макрофаги, лимфоциты) инфильтрацией, которая практически не определяется под боуменовой мембраной. Высокий уровень экспрессии виментина отмечен в кератоцитах, лимфоцитах, макрофагах и эндотелии новообразованных сосудов – клетках мезенхимального происхождения (рис. 1д). На всех срезах (окраска гематоксилином и эозином) выявлены зоны деформации или разрыва боуменовой мембраны. Эпителиальный слой неравномерный с интраэпителиальными кистами и плотной соединительной тканью, а также локальным отсутствием клеток на базальной мембране. Кроме того, обнаружены дистрофические изменения клеток и выраженная экспрессия цитокератина AE1/AE3 (рис. 1е).
Таким образом, изменения стромы и эпителия полнослойных роговиц, включенных в 1А группу, свидетельствуют о разных стадиях хронического локального воспалительного процесса: отеке, неоваскуляризации и ремоделировании ткани с исходом в фиброз – что подтверждает результаты ранее проведенных исследований [3].
Иммунофлуоресцентное исследование. Сравни-тельный анализ состояния эндотелиального слоя образцов ДМ-Э 2А и 2Б групп выявил уменьшение количества клеток, синтезирующих белок ZO-1, при ЭД Фукса, по сравнению с контролем (рис. 2а, б). В связи с тем, что визуализация некоторых клеток была затруднена, их количество определяли как среднее значение абсолютного числа ядер в каждом из изображений исследуемого образца. В результате было установлено, что в комплексах ДМ-Э, включенных во 2А группу, количество ЭК снижено (27,19 ± 12,77), по сравнению с контролем (50,82 ± 10,73). Площадь клеток ДМ-Э при ЭД Фукса составляет (490,99 ± 146,12) мкм2 и достоверно превышает аналогичный показатель в образцах 2Б группы, (343,69 ± 85,14) мкм2. Подобные изменения подтверждают описанный ранее феномен «распластывания» ЭК при их дефиците и слабой пролиферации in vivo [10]. Кроме того, механическая деформация клеточных мембран и цитоскелета, а также разрушение межклеточных контактов вызваны прогрессирующим ростом гутт в направлении от ДМ к ЭК. Так, при световой микроскопии в образцах ДМ-Э 2А группы визуализируются ядра вытянутой формы, смещенные к периферии ЭК (рис. 2а). Кроме того, обнаружено достоверное увеличение их площади (55,14 ± 19,02) мкм2, по сравнению с контролем (31,51 ± 13,02) мкм2. Вместе с тем, ЯЦО – показатель морфо-функционального состояния ЭК – не отличается в образцах 2А и 2Б групп, (0,14 ± 0,05) и (0,12 ± 0,04) соответственно, p = 0,329.
Рис. 1. Роговица при эндотелиальной дистрофии Фукса (ЭД Фукса) и в норме: а – цитокератин AE1/AE3 в эндотелиальных клетках (ЭК) при ЭД Фукса, ×200; б – виментин в ЭК при ЭД Фукса, ×400; в – десцеметова мембрана и ЭК при ЭД Фукса, ×100, гематоксилин и эозин, ЭК (белая стрелка), гутты (черная стрелка); г – десцеметова мембрана и ЭК в норме, ×100, гематоксилин и эозин, ЭК (белая стрелка); д – виментин в клетках стромы при ЭД Фукса, ×200; е – цитокератин AE1/AE3 в эпителиальных клетках при ЭД Фукса, ×200
Рис. 2. Эндотелий и десцеметова мембрана при эндотелиальной дистрофии Фукса (а) и в норме (б). Съемка в режиме детекции флуоресценции (белки межклеточных контактов ZO-1 окрашены в красный цвет, ядра – в синий цвет) и фазового контраста (гутты отмечены белыми стрелками); ×630
Таким образом, выявленные изменения морфометрических параметров ЭК подтверждают, что снижение прозрачности роговицы при ЭД Фукса обусловлено патологическими изменениями эндотелиального слоя, возникающими, в том числе, на фоне прогрессирующего роста гутт. Вместе с тем, отсутствие отклонения ЯЦО от показателей контроля, свидетельствует о том, что данные ЭК находятся в состоянии относительной компенсации и сохраняют функциональную активность. Представленные результаты иммунофлуоресцентного исследования коррелирует с тем, что все образцы ДМ-Э, включенные во 2А группу, были получены при эндотелиальной кератопластике у пациентов с ЭД Фукса без клинических признаков фиброза стромы.
Сканирующая электронная микроскопия. На изображениях образцов ДМ-Э 3А и 3Б групп был проведен сравнительный анализ пространственного расположения ЭК относительно друг друга и окружающих структур (рис. 3а–в). Так, в норме (3Б группа) полигональные ЭК с яркими ядрами округлой формы образуют монослой на поверхности ДМ (рис. 3в). При ЭД Фукса на изображениях ДМ-Э визуализируется иррегулярный пласт измененных ЭК и округлые образования ВКМ – гутты. Выявлена патологическая взаимосвязь между расположением этих структур. Так, гутты проминируют кпереди, приводя к деформации и выраженному полиморфизму ЭК (рис. 3а). На большем увеличении видно, что некоторые ЭК увеличены, их цитоплазматические мембраны истончены и расположены над гуттой, которая представляет собой плотноорганизованную структуру (рис. 3б).
Рис. 3. Изображение эндотелиальных клеток (ЭК) и десцеметовой мембраны при эндотелиальной дистрофии Фукса (ЭД Фукса) и в норме. Сьемка методом сканирующей электронной микроскопии в режиме BSE (а, б – десцеметова мембрана и ЭК при ЭД Фукса: цитоплазматическая мембрана ЭК (оранжевые, зеленые, желтые стрелки), ядро (синяя стрелка), гутта (красная звездочка); в – десцеметова мембрана и ЭК в норме: цитоплазматическая мембрана ЭК (оранжевая стрелка), ядро (синяя стрелка), десцеметова мембрана (зеленая звездочка).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, патогенез ЭД Фукса включает в себя постепенную эпителиально-мезенхимальную трансформацию ЭК, сопровождающуюся синтезом ВКМ – гутт, неуклонный рост которых деформирует цитоскелет ЭК. В результате нарушения межклеточных взаимодействий и уменьшения количества функционально активных ЭК возникает изменение проницаемости эндотелиального слоя с развитием хронического отека стромы и эпителия роговицы. В связи с этим патогенетически обусловленным способом восстановления прозрачности роговицы является эндотелиальная кератопластика с селективным замещением измененного комплекса ДМ-Э. Длительное течение ЭД Фукса, как правило, характеризуется критическим снижением числа функционально активных ЭК, переходом отека стромы в фиброз. Подобное состояние является показанием к проведению сквозной кератопластики, то есть замещению полнослойной роговицы аналогичной донорской тканью.
作者简介
Natalia Fisenko
M.M. Krasnov Scientific Research Institute of Eye Diseases
Email: natfisenko@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7198-4498
Scopus 作者 ID: 57192992418
PhD, Senior Researcher
俄罗斯联邦, MoscowYusef Yusef
M.M. Krasnov Scientific Research Institute of Eye Diseases
Email: info@eyeacademy.ru
ORCID iD: 0000-0003-4043-456X
Scopus 作者 ID: 57192982029
Doctor of Medical Sciences, Professor, Director
俄罗斯联邦, MoscowTatiana Demura
I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)
Email: demura-t@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6946-6146
Scopus 作者 ID: 25936132400
MD, Director of the Institute of Clinical Morphology and Digital Pathology
俄罗斯联邦, MoscowAnastasia Subbot
M.M. Krasnov Scientific Research Institute of Eye Diseases
Email: kletkagb@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8258-6011
Scopus 作者 ID: 55266556100
Candidate of Medical Sciences, Senior Researcher
俄罗斯联邦, MoscowIvan Novikov
M.M. Krasnov Scientific Research Institute of Eye Diseases
Email: i.novikov@niigb.ru
ORCID iD: 0000-0003-4898-4662
Scopus 作者 ID: 25951426100
Senior Researcher
俄罗斯联邦, MoscowGrigory Osipyan
; M.M. Krasnov Scientific Research Institute of Eye Diseases
编辑信件的主要联系方式.
Email: gregor79@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1056-4331
Scopus 作者 ID: 57200247282
MD, Head of Department of Eye optical system pathology
俄罗斯联邦, Moscow参考
- Fuchs E. Dystrophia epithelialis corneae. Graefes Arhiv für Ophthalmologie. 1910;76:478–508. doi: 10.1007/BF01986362.
- Matthaei M., Hribek A., Clahsen T. et al. Fuchs endothelial corneal dystrophy: clinical, genetic, pathophysiologic, and therapeutic aspects. Annu Rev Vis Sci. 2019;5:151–175. doi: 10.1146/annurev-vision-091718-014852.
- Ong Tone S., Kocaba V., Böhm M. et al. Fuchs endothelial corneal dystrophy: The vicious cycle of Fuchs pathogenesis. Prog Retin Eye Res. 2021;80:100863. doi: 10.1016/j.preteyeres.2020.100863.
- Brockmann T., Brockmann C., Maier A.B. et al. Primary Descemet’s membrane endothelial keratoplasty for Fuchs endothelial dystrophy versus bullous keratopathy: histopathology and clinical results. Curr Eye Res. 2018;43(10):1221–1227. doi: 10.1080/02713683.2018.1490773
- De Roo A.K., Janssens T., Foets B., van den Oord J.J. Immunohistochemical Profiling of Corneas With Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy. Cornea. 2017;36(7):866–874. doi: 10.1097/ICO.0000000000001212.
- Okumura N., Minamiyama R., Ho L. et al. Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy. Laboratory Investigation. 2015;95:1291–1304.
- Hidayat A.A., Cockerham G.C. Epithelial metaplasia of the corneal endothelium in Fuchs endothelial dystrophy. Cornea. 2006;25(8):956–959. doi: 10.1097/01.ico.0000228786.84581.ee.
- Xia D., Zhang S., Nielsen E. et al. The Ultrastructures and Mechanical Properties of the Descement’s Membrane in Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy. Sci Rep. 2016;6:23096. doi: 10.1038/srep23096.
- Weller J.M., Zenkel M., Schlötzer-Schrehardt U. et al. Extracellular matrix alterations in late-onset Fuchs’ corneal dystrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014;55(6):3700–3708. doi: 10.1167/iovs.14-14154.
- Joyce N.C. Proliferative capacity of the corneal endothelium. Prog Retin Eye Res. 2003;22(3):359–389. doi: 10.1016/s1350-9462(02)00065-4.
补充文件
