Влияние острой и хронической алкоголизации крыс на показатели окислительного стресса и метаболической активности печени в условиях in vitro

Полный текст

Алкогольное похмелье – это состояние, требующее изучения и разработки терапии, так как похмелье является широко распространенным состоянием, снижающим некоторые аспекты качества жизни и создающее риск травм, как у человека, испытывающего его, так и у окружающих его людей. Синдром алкогольного похмелья определяют как «совокупность психических и физиологических симптомов, которые испытывает человек после однократного эпизода употребления алкоголя в большом количестве, развивающихся на фоне отсутствия этанола в крови» [1]. По данным отчета Всемирной организации здравоохранениня о глобальном статусе потребления этанола на 2018 г. 18,2 % населения мира потребляет алкоголь в количестве, достаточном для развития похмелья [2].

Алкогольное похмелье является потенциально опасным состоянием, увеличивающим риск травматизации при управлении автомобилем или другим сложным механизмом. Люди, употреблявшие этанол перед тестовым заездом на велосипеде, показывали результаты, сопоставимые с людьми, концентрация алкоголя в крови которых составляла 0,3 г/кг [3]. Алкогольное похмелье также оказывает влияние на качества сна, недостаток которого также усиливает неврологический и когнитивный дефицит [4]. Состояние алкогольного похмелья у человека характеризуется возможным наличием 47 симптомов [5], поэтому при моделировании алкогольного похмелья у животных для последующей оценки влияния лекарственных средств на данное состояние следует использовать большое количество валидационных методов [6].

Окисление этанола под действием алкогольдегидрогеназы приводит к образованию ацетальдегида, который превращается в ацетат; обе эти последовательные и потом параллельные реакции уменьшают запасы никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и увеличивают концентрацию НАДН, снижая количество восстановленного глутатиона (GSH) [7]. Этанол подавляет синтез GSH, потеря этого соединения в митохондриях печени способствует повреждению органелл гепатоцитов и снижению их эффективности в отношении утилизации ксенобиотиков [7, 8]. Повышение концентрации НАДН вызывает ряд метаболических нарушений, включая гиперлактацидемию, которая способствует ацидозу и снижает экскрецию мочевой кислоты с мочой.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучить влияние введения ацетилцистеина на показатели метаболической активности печени in vitro, в условиях острой и длительной алкоголизации.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Провели 2 эксперимента с использованием крыс линии Вистар (масса тела 280–350 г). В первом эксперименте животных распределили на 3 группы по 10 особей. Крысам из первой группы (отрицательный контроль) вводили физиологический раствор (сначала внутрибрюшинно, а через 3 ч – внутрижелудочно); крысам из второй группы (опытная) и третьей группы (положительный контроль) однократно внутрибрюшинно вводили 20%-й раствор этанола в дозе 3 г/кг, а затем (после пробуждения) однократно внутрижелудочно вводили водный раствор ацетилцистеина в дозе 1 г/кг или физиологический раствор (в соответствии с группой). Объем растворов при внутрибрюшинном и внутрижелудочном введении составлял 15 и 5 мл/кг соответственно. Проводили перфузию печени с помощью стандартной методики. Животных наркотизировали при помощи внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата в дозе 400 мг/кг, после чего проводили лапаротомию и выделяли воротную вену и нижнюю полую вену, которые фиксировали канюлями 14 Fr. На протяжении перфузии из перфузионного контура выполняли отбор проб перфузата для общего и биохимического анализа. Изолированную печень подключали к перфузионной установке в порядке – воротная вена, нижняя полая вена. Базовый раствор для перфузии содержал: NaCl 120 ммоль/л, KH₂PO₄ 1,2 ммоль/л, MgSO₄ 1,2 ммоль/л, CaCl₂ 2,6 ммоль/л, NaHCO₃ 25 ммоль/л. Водородный показатель (pH) раствора составил 7,4, раствор при 37^о обогащали газовой смесью, содержащей 95%-й O₂ и 5%-й CO₂ [9].

Во втором эксперименте у всех животных, кроме интактных, в качестве единственного источника жидкости использовали 15%-й раствор этанола. В течение 1 недели животные получали стандартное питание и раствор этанола (положительный контроль, опыт) или обычную питьевую воду. Начиная со 2-й недели эксперимента животным из опытной группы ежедневно начинали вводить внутрижелудочно ацетилцистеин в дозе 500 мг/кг/сут. в течение 1 недели. Животным из обеих контрольных групп вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме. Для отбора образцов печени животных наркотизировали однократным внутрибрюшинным введением хлоралгидрата в дозе 400 мг/кг, после чего брюшную полость вскрывали, портальную вену изолировали и катетеризировали для подключения перфузионной системы, состоящей из перистальтического насоса, емкости с перфузионным раствором, который представлял собой 0,1 М фосфатно-солевой буфер (pH = 7,4). Об эффективности перфузии судили по изменению окраски и консистенции печени. По окончании перфузии животных умерщвляли, печень извлекали, измельчали и гомогенизировали в фосфатно-солевом буфере (1 : 4), после чего полученные гомогенаты центрифугировали при 9000 g в течение 20 мин. Определение активности ферментативных систем проводили в 96-луночных планшетах, в лунки которых вносили по 50 мкл супернатанта и 200 мкл среды RPMI, содержащей феноловый красный в качестве кислотно-основного индикатора. В качестве отрицательного контроля использовали супернатант, прокипяченный при 100 °С в течение 20 мин [10]. Планшеты помещали в шейкер-инкубатор (500 об./мин, 37 °С) на 30 минут, затем определяли абсорбцию образцов при 415 нм, что близко к максимуму поглощения кислотной формы фенолового красного.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Не выявили статистически значимых отличий между показателями активности АСТ в перфузате печени крыс из групп положительного, отрицательного контроля и из опытной группы (рис. 1 А). Активность АЛТ у животных из группы положительного контроля (52,00 ± 15,14) Ед/л и у животных, которым после интоксикации вводили ацетилцистеин (33,17 ± 4,36) Ед/л оказалась статистически значимо (p < 0,01) ниже, чем у животных, которым после интоксикации вводили физиологический раствор (30,50 ± 6,38) (рис. 1 Б).

Не выявили статистически значимых отличий между показателями концентрации ТГ в перфузате печени крыс из групп положительного, отрицательно контроля и из опытной группы (рис. 2 А). Концентрация глутатиона в перфузате печени крыс, получавших только этанол без лечения, была статистически значимо ниже (p < 0,01), чем у животных из группы отрицательного контроля. Данный показатель также был статистически значимо ниже (p < 0,05) у животных, получавших ацетилцистеин после интоксикации этанолом (рис. 2 Б). Не обнаружили статистически значимых отличий между показателями концентрации МДА у животных всех исследуемых групп (рис. 2 В). Обнаружили статистически значимое отличие показателей активности СОД у интактных животных при сравнении с показателями у животных, которым вводили этанол без лечения (p < 0,05). Показатель у животных, получавших ацетилцистеин, не отличался статистически значимо от показателей у животных из групп положительного и отрицательного контроля (рис. 2 Г).

 

Рис. 1. Активность аспартатаминотрансферазы (А) и аланинаминотрансферазы (Б) в перфузате печени крыс: АЦЦ – ацетилцистеин; АСТ – аспартатаминотрансфераза; АЛТ – аланинаминотрансфераза

 

Рис. 2. Результаты измерения концентрации триглицеридов (А), глутатиона (Б) и малонового диальдегида (В) и активности супероксиддисмутазы (Г) в перфузате печени: АЦЦ – ацетилцистеин; СОД – супероксиддисмутаза; МДА – малоновый диальдегид

 

Введение этанола с последующим введением ацетилцистеина или физиологического раствора не оказывало влияния на активность АСТ концентрацию ТГ и МДА. Выявили, что активность СОД в перфузате статистически значимо, но несущественно уменьшалась у животных, получавших этанол без последующего лечения относительно значений у интактных животных. Влияния введения ацетилцистеина на данный показатель не выявили.

Активность АЛТ в перфузате животных, которым после интоксикации этанолом вводили ацетилцистеин, оказалась статистически значимо ниже, чем у животных с похмельем без лечения. Таким образом, введение ацетилцистеина снижало активность АЛТ в перфузате печени крыс, подвергнутых острой алкоголизации. Концентрация глутатиона, наоборот, существенно снижалась, как при введении этанола без последующего лечения, так и при введении этанола с последующим введением ацетилцистеина. Тем не менее, среднее значение концентрации глутатиона было выше (87,67 ± 9) мг/мл, чем у животных из группы положительного контроля (80,17 ± 7,86) мг/мл.

Концентрация диеновых конъюгатов при индукции отравления этанолом увеличивалась статистически значимо (p < 0,05), при сравнении с показателями, полученными у интактных животных. Концентрация диеновых конъюгатов в перфузате животных, которым вводили ацетилцистеин, была сопоставима с показателем у животных из группы отрицательного контроля и была статистически значимо (p < 0,05) ниже, чем показатель у животных из группы положительного контроля (рис. 3).

Таким образом, концентрация диеновых конъюгатов в перфузате существенно увеличивалась при алкогольной интоксикации и приближалась к значениям у интактных животных при введении ацетилцистеина в постинтоксикационном периоде.

В ходе оценки активности ферментативных систем гепатоцитов на фоне хронической алкоголизации обнаружили статистически значимое увеличение в 3,5 раза абсорбции кислотной формы фенолового красного в лунках планшета, содержащих фракцию S9 крыс, подвергнутых алкоголизации, и в 3 раза – в лунках, содержащих фракцию S9 крыс, которых подвергли алкоголизации, после чего ввели ацетилцистеин (рис. 4, p < 0,001 в обоих случаях). Данные изменения связаны с индукцией цитоплазменных оксидаз, а также микросомальных оксигеназ и ряда изоферментов систем цитохрома P450, которая наблюдается как при острой, так и при хронической алкоголизации.

 

Рис. 3. Концентрация диеновых конъюгатов в перфузате печени крыс: АЦЦ – ацетилцистеин

 

Рис. 4. Относительная ферментативная активность фракции S9 печени крыс. Данные нормализованы по среднему значению Ar в контроле, данные представлены в виде среднего значения, минимума-максимума (усы) и интерквартильного размаха (короб): АЦЦ – ацетилцистеин

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Введение ацетилцистеина после острого отравления этанолом благоприятно сказывалось на состоянии антиоксидантных систем печени (глутатион), активности перекисного окисления липидов (диеновых конъюгатов) и токсическом повреждении печени (АЛТ).

Хроническая же алкоголизация приводила к изменению экспрессии и усилению активности оксидоредуктаз в печени. Активность S9 при использовании АЦЦ хоть и не отличалась от показателя у животных без лечения статистически значимо, была заметно ниже.

Об авторах

Владимир Иванович Петров

Волгоградский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: brain@sprintnet.ru

академик Российской академии наук, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой клинической фармакологии и интенсивной терапии

Россия, Волгоград

Назар Андреевич Осадченко

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: n.a.osadchenko@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7398-2186

очный аспирант кафедры клинической фармакологии и интенсивной терапии 

Россия, Волгоград

Список литературы

Дополнительные файлы