Коррекция экспериментального язвенного колита мелаксеном

Полный текст

Несмотря на большое число исследований, посвященных исследованию этиологии и патогенеза язвенного колита (ЯК), различные аспекты проблемы остаются не до конца изученными. До настоящего времени не установлены микроорганизмы, определяющие возникновение и развитие ЯК. Патогенез этого заболевания связывают с нарушением барьерных свойств слизистой кишечника, что приводит к пенетрации патогенной и облигатной микрофлоры из просвета кишечника в слизистую оболочку и подслизистый слой, активации макрофагов, нейтрофилов, моноцитов и развитию иммунного воспаления с последующим разрушением крипт и образованием язв и инфильтратов. Нарушения состава микрофлоры играют важную роль в развитии заболеваний кишечника [1], включая ЯК. Многие авторы отмечают недостаточную эффективность существующих методов лечения ЯК. В связи с этим поиск новых методов терапии этого заболевания представляет несомненный интерес.

Препарат «Мелаксен», действующим веществом которого является гормон мелатонин, хотя и был предложен как препарат для коррекции нарушений сна и циркадных ритмов, обладает уникальной совокупностью фармакологических эффектов [2], что открывает перспективы изучения его терапевтического действия при ЯК. Ранее показана эффективность мелатонина при декстран-индуцированном ЯК у мышей, причем механизм действия гормона авторы связывают с нарушением экспрессии и взаимодействия между EZH2 (гистон-лизин метилтрансферазой) и индуцибельной синтазой оксида азота 2 [3]. Гормон оказывает корригирующее влияние на течение ЯК, влияя на продукцию и активность ключевого фактора патогенеза ЯК NF-kB [4], а также проявляя антиоксидантное действие [5]. Однако данные о фармакологических эффектах мелаксена при ЯК отсутствуют.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучение влияния мелаксена на клинические и морфологические проявления ЯК у мышей.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены на 78 мышах-самцах Balb/C весом 21–23 г. Животные были разделены на следующие группы: 1) интактная – 6 мышей; 2) ЯК + физраствор внутрижелудочно – 24 мыши; 3) ЯК + мелаксен – 24 мыши; 4) ЯК + сульфасалазин – 24 мыши. ЯК моделировали заменой питьевой воды 5%-м раствором декстрана сульфата натрия (ДСН) (Mr = 40000, Pan Reac-Appli Сhem, ФРГ) в кипяченой воде на 5 суток [6]. Животных выводили из эксперимента на 5, 7-е и 28-е сутки цервикальной дислокацией под хлоргидратным наркозом и определяли: индекс активности болезни (ИАБ) с использованием 3 параметров: потеря веса, консистенция стула, ректальные кровотечения [6]. Баллы для каждого показателя (от 0 до 4) суммировали, максимальное значение индекса соответствует 12. Наличие крови в фекалиях выявляли с помощью бензидиновой реакции. Световую микроскопию проводили на микроскопе Nicon Eclipse Ni с использованием программного обеспечения NIS Elements AR. Для оценки выраженности язвенно-некротического процесса на гистологических препаратах дистального отдела ободочной кишки, окрашенных гематоксилином и эозином, измеряли распространенность язв слизистой оболочки толстого кишечника и воспалительных инфильтратов в собственной пластинке слизистой оболочки, длину мышечной пластинки. В программе Microsoft Office Excell 2020 рассчитывали распространенность воспалительных изменений в процентах от длины мышечной пластинки.

Мелаксен применяли внутрижелудочно в виде суспензии в физиологическом растворе в дозе 0,5 мг/кг в объеме 0,3 мл в течение 7 суток с начала моделирования ЯК. Выбор дозы основывается на данных литературы о высокой эффективности мелаксена в этой дозе [7]. Сульфасалазин («КРКА», Словения) вводили мышам внутрижелудочно в виде суспензии в физрастворе в дозе 200 мг/кг в объеме 0,3 мл семикратно с начала моделирования ЯК. Физраствор вводили внутрижелудочно (0,3 мл) 1 раз в сутки 7 дней. Эксперименты проведены с соблюдением принципов гуманного отношения к лабораторным животным [8], Правил надлежащей лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ МЗ РФ № 199н от 01.04.2016 г.) и одобрены Региональным этическим комитетом КГМУ (протокол заседания секции доклинических исследований РЭК № 1 от 03.04.2023).

Непараметрический U-критерий Манна – Уитни использовали для проверки статистических гипотез при p ≤ 0,05. Материал представлен как медиана (Me), нижний (Ql) и верхний (Q3) квартили. Статистическая обработка выполнена с помощью программного обеспечения Statistica версия 13.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Индекс активности болезни на 5–7-е сутки у мышей контрольных групп с ЯК существенно не изменялся и составил от 6 до 7 баллов. Установлено уменьшением длины толстого кишечника на 31,0 и 34,7 % соответственно на 5-е и 7-е сутки по сравнению с интактными мышами (p = 0,00094) (табл.). При введении суспензии мелаксена мышам с ЯК на 5-е и 7-е сутки эксперимента установлено статистически достоверное снижение ИАБ – на 34,7 % (p = 0,0357) и 35,7 % (p = 0,0074) соответственно по сравнению с мышами контрольной группы, а также уменьшение патологического укорочения толстого кишечника на 26,9 и 25,1% (p = 0,00094). Использование препарата сравнения сульфасалазина у мышей с ЯК приводило к снижению ИАБ на 20,0 % (p = 0,0406) только на 7-е сутки эксперимента, уменьшению патологического укорочения толстого кишечника на 11,1 % (p = 0,0014) и 9,1 % (p = 0,0074) по сравнению с контрольной группой на 5-е и 7-е сутки эксперимента. На 28-е сутки при развитии хронического ЯК не установлено значимых различий ИАБ в контрольной группе, группе ЯК + мелаксен, группе ЯК + сульфасалазин.

 

Влияние мелаксена и сульфасалазина на ИАБ, длину толстого кишечника, распространенность язв и инфильтратов у мышей с язвенным колитом

Экспериментальная группа	Срок эксперимента, сутки	Индекс активности болезни, баллы	Длина кишечника, см	Распростра-ненность язв, %	Распростра-ненность инфильтратов, %
1. Интактная группа	–	–	13,7 [13, 45; 14, 1]	–	–
2. Контрольная группа	5	6,0 [4, 5; 8, 0]	9,45 [8, 95; 9, 75] х p = 0,00094	11,4 [10, 3; 12, 0]	25,8 [22, 0; 29, 0]
	7	6,0 [5, 0; 7, 0]	8,95 [8, 8; 9, 25] х p = 0,00094	24,2 [21, 2; 27, 7]	54,6 [49, 1; 60, 6]
	28	–	13,4 [12, 95; 14, 0] p = 0,3184	0,92 [0, 55; 1, 39]	26,4 [22, 4; 29, 0]
3. Группа язвенный колит + мелаксен	5	4,0 [3, 0; 4, 0]* p = 0,0357*	11,8[11, 6; 12, 25]*1 p = 0,0094* p = 0,00161	7,3 [6, 7; 8, 9]* p = 0,0039	22,0 [19, 2; 26, 4] p = 0,0831
	7	4,5 [4, 0; 5, 0]* p = 0,0074*	11,45[10, 95;12, 35]*1 p = 0,00094* p = 0,00191	10,4 [9, 3; 11, 1]* p = 0,0009	25,4 [21, 7; 28, 5]* p = 0,0009
	28	–	13,7 [13, 35; 14, 55] 1 p = 0,01811	0,27 [0, 00; 0, 38]* p = 0,0136	17,8 [16, 0; 19, 4]* p = 0,0028
4. Группа язвенный колит + сульфасалазин	5	5,0 [4, 0; 7, 5] p = 0,6365*	10,5 [10, 15; 11, 1]* p = 0,0014	6,1 [4, 3; 7, 9]* p = 0,0009	25,4 [22, 7; 28, 1] p = 0,8748
	7	5,0 [4, 0; 5, 0]* p = 0,0406*	9,75 [9, 4; 10, 25] * p = 0,0074	11,8 [10, 8; 12, 7]* p = 0,0009	31,3 [27, 1; 36, 9]* p = 0,0014
	28	–	13,05[12, 55; 13, 55] p = 0,0587	0,42 [0, 00; 0, 94] p = 0,1152	19,1 [17, 6; 20, 7]* p = 0,0054

* p < 0,05 по сравнению с контрольной группой; ¹ p < 0,05 по сравнению с группой ЯК + сульфасалазин.

 

Моделирование мышам Balb/C ДСН-индуцирован-ного ЯК приводило к формированию язв слизистой оболочки толстого кишечника и инфильтратов в собственной пластинке слизистой оболочки (СПСО) и подслизистом слое (рис.). Медиана распространенности язв слизистой оболочки составила на 5-е и 7-е сутки эксперимента 11,39 и 24,20 % соответственно. У мышей с хроническим ЯК наличие язв отмечено у всех животных, однако медиана распространенности имела очень низкое значение 0,92 %. Аналогичная динамика установлена при анализе распространенности инфильтратов в СПСО. На 5-е и 7-е сутки показатели в контрольной группе составили 26,85 и 54,62 % соответственно. У мышей с хроническим ЯК величина показателя распространенности составила 26,35 %.

 

Рис. Язвы и инфильтраты ободочной кишки самцов мышей Balb/C с экспериментальным язвенным колитом: а – воспалительный инфильтрат в подслизистом слое, контрольная группа; б – язва слизистой оболочки ободочной кишки, контрольная группа; в – воспалительный инфильтрат в подслизистом слое, группа язвенный колит + мелаксен; г – язва слизистой оболочки ободочной кишки, группа язвенный колит + мелаксен. Бар – 100 µm. Окраска гематоксилин + эозин

 

Корригирующее действие мелаксена на развитие экспериментального ЯК на 5-е сутки проявлялось уменьшением распространенности язв слизистой оболочки на 36,0 % (p < 0,05). На 7-е сутки эксперимента отмечено статистически достоверное снижение обоих изучаемых показателей: распространенности язв в 2,3 раза и инфильтратов – на 53,5 % (p < 0,05). На 28-е сутки (хронический ЯК) язвы слизистой выявлены только у 2 из 8 животных (25 %), а медиана в 3,4 раза ниже, чем в контрольной группе (p < 0,05).

Препарат сравнения сульфасалазин также оказывал терапевтическое действие на течение ЯК. На 5-е сутки установлено только уменьшение распространенности язв на 46,5 % (p < 0,05).

На 7-е сутки распространенность язв в 2,1 раза, а инфильтратов СПСО – на 43,0 % меньше, чем в контрольной группе (p < 0,05). Из 8 мышей с хроническим ЯК только у 3, получавших сульфасалазин, наблюдалось наличие язв слизистой, однако медиана не отличалась достоверно от показателя контрольной группы. Распространенность инфильтратов на 27,7 % меньше, чем в контрольной группе (p < 0,05).

В работе установлено терапевтическое действие препарата «Мелаксен» на клинические и морфологические проявления экспериментального ЯК, что проявляется уменьшением ИАБ, распространенности язв и инфильтратов в стенке кишечника. При этом указанный эффект препарата выше, чем у сульфасалазина, широко применяемого при лечении ЯК, и это подтверждается значимыми различиями патологического укорочения толстого кишечника у мышей с ЯК, получавших мелаксен и сульфасалазин. Известно, что мелатонин синтезируется энтерохромаффинными клетками кишечника, причем ее уровень в 400 раз превышает аналогичный показатель эпифиза [9]. При введении экзогенного мелатонина он накапливается в стенке кишечника [9]. Ранее показано, что введение мелатонина снижает секрецию провоспалительных цитокинов и активность миелопероксидазы у мышей с ожирением и ЯК. По-видимому, терапевтический эффект препарата мелаксен при ДСН-индуцированном колите у мышей связан с подавлением продукции провоспалительных интерлейкинов и миелопероксидазы. Также установлено, что мелатонин корригирует состав микробиоты и усиливает образование окклюдинов, оказывает антиоксидантное действие [5].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные позволяют сделать вывод о наличии у мелаксена корригирующего влияния на развитие экспериментального ЯК, что проявляется уменьшением ИАБ, патологического укорочения толстого кишечника, распространенности язв и инфильтратов в стенке толстого кишечника. Механизм фармакологического эффекта мелаксена связан, по-видимому, с подавлением продукции провоспалительных цитокинов, активности миелоперксидазы, антиоксидантным действием препарата.

Об авторах

Андрей Юрьевич Ляшев

Курский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: andr.liashev@yandex.ru

прикрепленный для подготовки диссертации к кафедре фармакологии

Россия, Курск

Галина Сергеевна Маль

Курский государственный медицинский университет

Email: malgs@kursksmu.net

доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой фармакологии

Россия, Курск

Алексей Владимирович Солин

Белгородский государственный национальный исследовательский университет

Email: medps@yandex.ru

доктор медицинских наук, доцент, профессор кафедры анатомии и гистологии

Россия, Белгород

Мария Алексеевна Затолокина

Курский государственный медицинский университет; Орловский государственный университет имени И.С. Тургенева

Email: marika1212@mail.ru

доктор медицинских наук, профессор кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии, Курский государственный медицинский университет; заведующая кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии, Медицинский институт, Орловский государственный университет имени И.С. Тургенева

Россия, Курск; Орел

Вадим Сергеевич Сериков

Курский государственный медицинский университет

Email: serikov-stom@yandex.ru

кандидат медицинских наук, доцент кафедры детской стоматологии

Россия, Курск

Юрий Дмитриевич Ляшев

Курский государственный медицинский университет

Email: ylyashev@yandex.ru

доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры патофизиологии

Россия, Курск

Кирилл Дмитриевич Спиридонов

Курский государственный медицинский университет

Email: kirill.spiridonov.2012@bk.ru

6-й курс, лечебный факультет, 7-я группа

Россия, Курск

Даниил Дмитриевич Спиридонов

Курский государственный медицинский университет

Email: d.spiridonov2112@gmail.com

6-й курс, лечебный факультет, 7-я группа

Россия, Курск

Алексей Владимирович Тверской

Белгородский государственный национальный исследовательский университет

Email: tverskoy@bsu.edu.ru

кандидат медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой анатомии и гистологии человека, Медицинский институт

Россия, Белгород

Список литературы

Дополнительные файлы