Темновая цитотоксичность впервые синтезированных комплексов на основе Хлорина е6 с редкоземельными элементами на культуре клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха
- Авторы: Шевченко О.В.1,2, Елисеева Е.В.1, Юрьева К.А.1, Белобелецкая М.В.2, Медков М.А.2
-
Учреждения:
- Тихоокеанский государственный медицинский университет
- Институт химии Дальневосточного отделения Российской академии наук
- Выпуск: Том 22, № 3 (2025)
- Страницы: 143-149
- Раздел: Оригинальные исследования
- URL: https://journals.eco-vector.com/1994-9480/article/view/692514
- DOI: https://doi.org/10.19163/1994-9480-2025-22-3-143-149
- ID: 692514
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Остро стоит вопрос о безопасности и селективности действия новых классов соединений, свойства которых не были описаны ранее. Цель настоящей статьи заключается в представлении результатов по изучению темновой токсичности и накоплении впервые синтезированных субстанций Хлорин е6-европий и Хлорин е6-самарий в отношении культуры клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха. Оценка этих параметров необходима с точки зрения понимания уровня токсичности и потенциальных побочных эффектов, поскольку известно, что применяемые в клинической практике вещества являются инициаторами фотореакций у пациентов. Методом калориметрического МТТ-теста для оценки метаболической активности клеток показано, что после 2 сут. контакта субстанций Хлорин е6-европий и Хлорин е6-самарий в концентрациях 25–0,19 мкг/мл количество жизнеспособных клеток составило более 80 %. С применением проточной цитофлуориметрии определено максимальное накопление веществ в клетках уже через 1 сут. со-инкубации. Полученные показатели позволили определить диапазон вносимых концентраций, при которых отмечено отсутствие прямого цитотоксического действия вещества на культуру клеток. Эти данные будут являться основой для дальнейшей оценки эффективности соединений и механизма их действия.
Ключевые слова
Полный текст
Одним из необходимых оценочных параметров при разработке потенциальных фотосенсибилизаторов (ФС) является темновая цитотоксичность [1, 2, 3]. Известно, что механизм действия ФС основывается на способности им поглощать квант света с последующей генерацией активных форм кислорода, разрушающих клетки опухоли. Несмотря на это, необходимо оценивать безопасность именно соединения, без воздействия источником излучения, для выбора безопасных концентраций с целью проведения дальнейших работ [2, 3]. Более того, выбор диапазона вносимых концентраций веществ также должен основываться на селективности накопления субстанций в опухолевых клетках для уменьшения эффекта воздействия на непораженные участки [4].
В рамках настоящего исследования проведено изучение темновой токсичности впервые синтезированных порошков Хлорин е6-европий и Хлорин е6-самарий в отношении культуры клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха (АКЭ) методом спектрофотометрического калориметрического МТТ-теста. С применением метода проточной цитометрии проведена количественная оценка накопления Хлорина е6 (вещество сравнения), Хлорин е6-европий и Хлорин е6-самарий.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Оценить темновую токсичность впервые синтезированных комплексов на основе Хлорина е6, допированного редкоземельными элементами, на модели клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Синтез комплексных соединений. В работе использовали коммерческий препарат «Фотодитазин» (Хлорин е6, ООО «Вета-Гранд, Россия), хлорид европия EuCl3∙6Н2О (х.ч.), хлорид самария SmCl3∙6Н2О (х.ч.). Концентрации Хлорина Е6 и Eu(III) или Sm(III) в исходных растворах составляли 5 × 10-3 моль/л и 6,6 × 10-3 моль/л соответственно. Предварительно в каждом из исходных растворов создавали рН = 6,5–7,3 добавлением к раствору димеглюмина хлорина Е6 разбавленной 1:1 соляной кислоты HCl (х.ч.), а к раствору хлорида европия или хлорида самария 10%-го раствора аммиака NH4OH. К раствору, содержащему Хлорин е6, добавляли раствор европия или самария в мольном соотношении 1 : 1 при перемешивании на магнитной мешалке до образования осадка. Образующийся в виде осадка продукт взаимодействия (комплекс) хлорина Е6 с европием или самарием отфильтровывали и высушивали на воздухе.
Подготовка клеточной культуры. Культивирование клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха осуществляли согласно протоколу [5]. Все исследования проведены после одобрения Междисциплинарным комитетом по этике ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России (протокол № 8 от 08.04.2024).
Определение темновой токсичности и накопления. Для оценки темновой токсичности исследуемые вещества в концентрациях от 0,19 до 100 мкг/мл (при двукратном разбавлении) вносили к культуре клеток АКЭ (1 × 106 кл/мл) через 1 сут. после посадки в 96-луночный планшет с дальнейшим помещением в CO2-инкубатор и ограниченным воздействием прямых солнечных лучей. Количество жизнеспособных клеток отмечали через 2 сут. контакта с применением МТТ-теста согласно методике [6], регистрируя сигнал оптической плотности на спектрофотометре Allsheng FlexA-200 (Allsheng, КНР) при λ = 530. Референсные значения определяли при λ = 620 нм. При интерпретации результатов 100 % жизнеспособных клеток составляли оптические плотности, содержащие клетки отрицательного контроля (интактные), то есть без внесения исследуемых субстанций. Все измерения проводили в трехкратной повторности. В качестве вещества сравнения во всех исследованиях применяли широко применяемый фотосенсибилизатор порфиринового ряда Хлорин е6. Количественное изучение клеток, поглотивших изучаемые вещества, оценивали с применением метода проточной цитофлуориметрии (MacsQuant Analyzer 10, Militenyi Biotec, Германия) при трехкратном измерении по каналу R1 (λвозбуждения = 635 нм, λиспускания = 655–730 нм). Анализ данных осуществляли с помощью программного обеспечения Kaluza Analysis 2.8 (Beckman Coulter, США).
Статистический анализ данных. Полученные данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Статистический анализ выполнен с использованием ANOVA, реализованного в программном обеспечении Sigma Plot 11.0 (Systat Software Inc., США). Различия между группами считались значимыми, если соответствующее p-значение было меньше 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Согласно данным калориметрического МТТ-теста процент жизнеспособных клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха на 2-е сутки после внесения суспензии Хлорин е6-европий в концентрации 100 мкг/мл составил (77,82 ± 3,89) %. Для меньших концентраций количество метаболически-активных клеток более 80 %. Отмечено (95,22 ± 4,76) % живых интактных клеток и (11,86 ± 0,59) % клеток положительного контроля (после внесения 20 % диметилсульфоксида) (рис. 1).
Рис. 1. Жизнеспособность клеток АКЭ через 2 сут. контакта с Хлорин е6-европий по данным МТТ-теста
Аналогичные исследования темновой токсичности проведены для Хлорина е6, допированного самарием. Результаты демонстрируют высокую жизнеспособность для всего диапазона вносимых к культуре АКЭ концентраций: (97,80 ± 2,45) % для 100 мкг/мл (рис. 2).
Рис. 2. Жизнеспособность клеток АКЭ через 2 сут. контакта с Хлорин е6-самарий по данным МТТ-теста
Следует отметить, что исследовалась также токсичность Хлорина е6 как контрольного вещества в условиях отсутствия непосредственного воздействия лучей света. Выживаемость клеток более 80 % отмечена для 12,5 мкг/мл, (85,85 ± 4,29) %, и ниже, при прежних значениях контролей. Наиболее токсичными оказались концентрации: 100; 25 и 12,5 мкг/мл. После контакта со 100 мкг/мл количество мертвых клеток составило (84,05 ± 4,20) % (рис. 3).
Рис. 3. Жизнеспособность клеток АКЭ через 2 сут. контакта с Хлорин е6 по данным МТТ-теста. Ось абсцисс – краситель аллофикоцианин (аllophycocyanin, APC), канал В6; ось ординат – количество клеток в 100 мкл, абс. ед.
Для объяснения этих явлений изучали биодоступность (интенсивность накопления) впервые полученных веществ в клетках АКЭ.
Согласно данным проточной цитофлуориметрии количество флуоресцирующих клеток, то есть поглотивших вещества, через 1 сут. после контакта с концентрациями Che6-Eu от 100 до 25 мкг/мл составило от (99,21 ± 4,96) и (98,93 ± 4,95) % соответственно.
После контакта с 100 мкг/мл Che6-Sm (99,17 ± 4,96) %. Для свободной молекулы Хлорина е6: 100 мкг/мл (92,44 ± 4,62) % и для 25 мкг/мл (89,74 ± 4,49) %, при значениях отрицательного контроля (0,04 ± 0,002) % и (98,93 ± 1,98) % для положительного (рис. 4).
Рис. 4. Гистограммы интенсивности флуоресценции клеток аденокарциномы Эрлиха через 2 сут. контакта с: а) 25 мкг/мл Хлорин е6-европий; б) 25 мкг/мл Хлорин е6-самарий; в) интактными клетками (без внесения Chе6-Eu или Chе6-Sm); г) клетками положительного контроля (20 % ДМСО)
Результаты свидетельствуют о большей биодоступности Хлорин е6-европий в ряду впервые синтезированных веществ для клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха. Стоит отметить, что при максимальном накоплении вещества через 1 сут. контакта значения темновой токсичности остаются низкими, что обуславливает, на начальном этапе, безопасность применения веществ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В рамках настоящего исследование проведено изучение возможности накопления впервые синтезированных субстанций на основе фотосенсибилизатора порфиринового ряда Хлорина е6, допированного редкоземельными элементами европием или самарием. Полученные данные по накоплению в клетках АКЭ согласуются с результатами по темновой токсичности соединений. Стоит отметить высокую токсичность не допированного Хлорина е6, которая при 100 мкг/мл в (4,88 ± 0,24) раза превышает значения для Che6-Eu и в (6,13 ± 0,31) раза для Che6-Sm, что подтверждается многочисленными исследованиями [7, 8, 9, 10], в том числе на клетках глиомы и нормальных нервных клетках [8]. Таким образом, полученный нами материал представляет собой перспективную платформу в качестве фотосенсибилизатора нового поколения.
Об авторах
Ольга Вячеславовна Шевченко
Тихоокеанский государственный медицинский университет; Институт химии Дальневосточного отделения Российской академии наук
Автор, ответственный за переписку.
Email: shevchenko.ov@tgmu.ru
кандидат биологических наук, научный сотрудник Междисциплинарного лабораторного центра
Россия, Владивосток; ВладивостокЕкатерина Валерьевна Елисеева
Тихоокеанский государственный медицинский университет
Email: yeliseeff23@gmail.com
доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой общей и клинической фармакологии
Россия, ВладивостокКсения Андреевна Юрьева
Тихоокеанский государственный медицинский университет
Email: yureva.ka@tgmu.ru
обучающаяся 4 года по специальности «Медицинская биохимия»
Россия, ВладивостокМаргарита Витальевна Белобелецкая
Институт химии Дальневосточного отделения Российской академии наук
Email: rita@ich.dvo.ru
кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории переработки минерального сырья
Россия, ВладивостокМихаил Азарьевич Медков
Институт химии Дальневосточного отделения Российской академии наук
Email: medkov@ich.dvo.ru
доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией переработки минерального сырья
Россия, ВладивостокСписок литературы
- Яницкая А.В., Ярковой М.А., Малаева Е.В., Землянская И.В. Струсовская О.Г. Анатомо-морфологическое изучение плодов Psoralea corylifolia L. (Fabaceae). Волгоградский научно-медицинский журнал. 2019;4:50–53.
- Correia J.H., Rodrigues J.A., Pimenta S., Dong T., Yang Z. Photodynamic Therapy Review: Principles, Photosensitizers, Applications, and Future Directions. Pharmaceutics. 2021;13(9):1332. doi: 10.3390/pharmaceutics13091332.
- Li Y., Zhang P., Xie Y., Yang J., Yang Y., Shi L. et al. Photosensitizers with multiple degradation modes for efficient and postoperatively safe photodynamic therapy. Biomaterials. 2023;299:122182. doi: 10.1016/j.biomaterials.2023.122182.
- Баранов А.В., Корнев А.И., Борискин А.А., Мустафаев Р.Д., Дербенев В.А., Горин Д.С. и др. Накопление фотосенсибилизатора в слизистой оболочке мочевого пузыря при хроническом цистите. Лазерная медицина. 2021;24(2–3): 9–14. doi: 10.37895/2071-8004-2020-24-2-3-9-14.
- Abdulrahman J.M., AbdElsamie G.H., Al-Rawi R.A., Abd El Kaream S.A. Anti-tumor synergistic activity of nano-chlorophyll with sonophotodynamic on Ehrlich ascites carcinoma in mice. Zanco Journal of Medical Sciences. 2020;24(1): 132–142. doi: 10.15218/zjms.2020.016.
- Otvagin V.F., Kuzmina N.S., Kudriashova E.S., Nyuchev A.V., Gavryushin A.E., Fedorov A.Y. Conjugates of Porphyrinoid-Based Photosensitizers with Cytotoxic Drugs: Current Progress and Future Directions toward Selective Photodynamic Therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 2022;65(3):1695–1734. doi: 10.1021/acs.jmedchem.1c01953.
- Капинус В.Н., Каплан М.А., Ярославцева-Исаева Е.В., Спиченкова И.С., Иванов С.А. Применение хлорин Е6-фотодинамической терапии базально-клеточного рака кожи. Исследования и практика в медицине. 2021;8(4):33–43. URL: https://doi.org/10.17709/2410-1893-2021-8-4-3.
- Žárská L., Malá Z., Langová K., Malina L., Binder S., Bajgar R. et al. The effect of two porphyrine photosensitizers TMPyP and ZnTPPS4 for application in photodynamic therapy of cancer cells in vitro. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2021;34:102224. doi: 10.1016/j.pdpdt.2021.102224.
- Shimolina L.E., Khlynova A.E., Gulin A.A., Elagin V.V., Gubina M.V., Bureev P.A. et al. Photodynamic therapy with Photoditazine increases microviscosity of cancer cells membrane in cellulo and in vivo. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 2024;259:113007. doi: 10.1016/ j.jphotobiol.2024.113007.
- Zhao X., Liu J., Fan J., Chao H., Peng X. Recent progress in photosensitizers for overcoming the challenges of photodynamic therapy: From molecular design to application. Chemical Society Reviews. 2021;50(6):4185–4219. doi: 10.1039/D0CS00173B.
Дополнительные файлы
