EVALUATION OF TOXICITY TESTING OF DIFFERENT ANTIGENS OF BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI ON CELL LINES IN VITRO

全文:

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Выбор клеточной модели для определения токсических свойств антигенов возбудителя мелиоидоза in vitro и разработка оптимизированных условий постановки тестов цитотоксичности, предназначенных для выявления in vitro токсичных компонентов в биологически активных комплексах, изолированных из микробных клеток возбудителя мелиоидоза. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование выполнено на модели двух монослойных клеточных линий: L929 (мышиные фибробласты) и CHO-K1 (клетки яичника китайского хомячка), полученных из Российской коллекции клеточных культур позвоночных (РККК П) института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург). Вне периода постановки опытов коллекционные культуры клеток сохраняли в криоконсервированном состоянии в биохранилище с жидким азотом при -196 оС. Все этапы работы с перевиваемыми линиями клеток были выполнены в соответствии с рекомендациями [4, 7]. Для культивирования клеток использовали пластиковую посуду различного формата для работы с клеточными культурами (Multiple well plates, ф. Costar) и отечественную полусинтетическую питательную среду F12 производства ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов» института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН. На ее основе готовили полную среду выращивания, используемую на всех этапах работы с клеточными культурами [4]. Для снятия монослоя кле ток с поверхности пластика применяли коммерческие растворы трипсина и версена. Культивирование проводили в СО2-инкубаторе при 37 оС, концентрации СО2 5— 7 %, влажности не менее 70 %. Каждый цикл исследований по проверке цитотоксичности испытуемых образцов антигенов состоял из ряда последовательных эпапов: размораживание клеток L929 и CHO-K1, их адаптация к условиям культивирования, контроль жизнеспособности клеток, морфологии и адгезивных свойств, пролиферативной активности. Для оценки жизнеспособности клеток использовали тест окраски трипановым голубым [1]. В течение первых двух недель в периоде адаптации индикаторных культур к условиям культивирования ежедневно просматривали высевы с помощью инвертированного микроскопа. Смену среды и пересевы клеток выполняли каждые 3—4 суток, постепенно наращивая популяцию каждой из линий до концентраций, необходимых для выполнения основных опытов. На этапе подготовки были определены оптимальные концентрации кл/см2 поверхности лунки, обеспечивающие формирование в течение суток монослоя клеток-мишеней, равномерно заполняющего всю площадь лунки. При выполнении микроварианта теста цитотоксичности, применявшегося для множественного скрининга различных антигенов возбудителя мелиоидоза, использовали 48-луночные (48-л) пластины, в лунки которых вносили по 6 X 104 клеток в объеме 0,25 мл. Для изучения динамики гибели клеток-мишеней вследствие контакта с антигеном был изменен формат плас- 72 Выпуск 2 (42). 2012 тин. В каждую лунку 12-луночных (12-л) пластин вносили по 3 х105 клеток в объеме 1 мл. Через сутки пластины со сформированным монослоем клеток-мишеней были готовы к постановке основных опытов. Как в первом, так и во втором варианте исследования выполняли одновременно на двух линиях клеток. Объектами тестирования являлись антигены Burkholderia pseudomallei (10 образцов), отличавшиеся по химическому составу и локализации в микробной клетке, изолированные из капсульной субстанции, клеточной стенки или являвшиеся смесью водорастворимых компонентов бактерий, прошедшие контроль специфической стерильности. Объемы вносимых образцов варьировали в зависимости от формата опытных пластин (от 1—2 до 40 мкл). На каждой пластине в 2—3 лунки с монослоем антиген не вносили (контроль). Время контакта клеток с антигеном — 3 суток, условия инкубации, как описано выше, просмотр и регистрация результатов — ежедневно. Учету подлежали время контакта биологически активного вещества с клетками, концентрации вносимых веществ в лунку, морфологические изменения и адгезивные свойства клеток. При учете результатов использовали качественные и количественные показатели (в зависимости от целевой установки конкретного опыта). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Возможность работы с паспортизированными клеточными линиями с хорошо изученными свойствами (морфология клеток, характер роста, питательные потребности) в значительной степени облегчила выполнение подготовительных этапов по адаптации культур L929 и CHO-K1 к конкретным условиям и последующей оптимизации режимов наращивания популяций в культуральных пластинах различного формата. При этом была изучена не только типичная морфология клеток, но и проведена оценка репродуктивного потенциала популяций. Анализ характера кривых роста популяций свидетельствовал об активной пролиферации клеток в оптимизированных условиях их культивирования, а также позволил определить временной интервал, при котором среда культивирования не истощается и возможен корректный учет результатов воздействия антигенов на клетки-мишени, равный 4 суткам (рис.). При постановке микроварианта теста цитотоксичности в лунки опытных 48-л пластин вносили образцы антигенов в объеме 20 мкл. В течение 3 суток наблюдения было отмечено нарастание изменений в популяциях клеток. В случаях токсического воздействия антигенов на монослой клеток индикаторных культур изменялась их форма, появлялись удлиненные, округлые, увеличенные в объеме, полигональные клетки, внутриклеточные включения, разрушенные клетки и их тени, детрит в межклеточных пространствах, участки свободной поверхности пластика, площадь которых при нарастании числа погибших клеток увеличивалась. о 0 - 0 12 3 4 время {сутки) Рис. Кривые роста популяций клеток L929 и CHO-K1 в течение срока наблюдения В результате первичного тестирования образцов антигенов установлено, что наиболее выраженным токсическим воздействием на клетки-мишени обладали экзополисахариды внеклеточной капсульной субстанции B. pseudomallei 100 и 57576, вызвавшие массовую гибель клеток L929 и CHO-K1 уже в течение первых суток. В то же время какие-либо изменения в монослой-ных культурах линий L929 и CHO-K1 в присутствии двух антигенов, липида А и кор-антигена B. pseudomallei 100 не отмечены. Различную степень цитопатогенности проявили остальные из проверенных антигенов (гликопротеин капсулы B. pseudomallei 100, кор-Аг B. pseudomallei 57576, комплекс Аг 6+d B. pseudomallei 57576, водносолевые экстракты B. pseudomallei51274, 60913 и 100). Микровариант теста цитотоксичности был использован для определения минимальных токсических доз (МТД) антигенов, использованных в работе. Этот показатель МТД является характеристикой конкретного образца препарата и был необходим для корректной оценки результатов экспериментов по изучению динамики гибели клеток-мишеней при контакте с антигенами B. pseudomallei, выполненных в формате 12-л пластин, с подсчетом относительных показателей жизнеспособности клеток при воздействии на них различных доз антигенов. В опытах по изучению динамики гибели клеток-мишеней при контакте с антигенами B. pseudomallei, применявшихся в различных дозировках, были получены следующие данные (рис. 2). Установлено, что через сутки после внесения 3 МТД экзополисахарида B. pseudomallei 100 в лунки со сформированным монослоем клеток наступала массовая гибель в популяциях клеток как L929, так и СНО-К1. Этот факт свидетельствовал о том, что данные линии клеток пригодны для использования в качестве индикаторных культур при выявлении случаев острой токсичности в течение относительно короткого периода времени (1 сут), особенно когда это касается биополимеров, входящих в группу факторов вирулентности B. pseudomallei. Антигены внеклеточной субстанции B. pseudomallei были представлены еще одним антигеном — гликопротеином 200 kDa B.pseudomallei 100. В субтоксической дозировке 0,5 МТД он не вызывал патологических изменений клеток-мишеней. Эти данные будут востребо Выпуск 2 (42). 2012 73 ваны нами для коррекции схем иммунизации животных-продуцентов специфических сывороток к антигену-маркеру вирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза. Выраженное цитопатогенное воздействие на клетки-мишени оказал кор-антиген B. pseudomallei 57576, который в дозировке 0,8 МТД вызывал к концу срока наблюдения гибель 20 и 25 % клеток в популяциях линий L929 и СНО-К1 соответственно. При этом отличия в снижении жизнеспособности клеток линий L929 и СНО-К1 по сравнению с началом опыта как в первом, так и во втором случае были достоверными (р < 0,05). При этом следует отметить, что во всех апробированных вариантах тестов существенных отличий в чувствительности клеток L929 и СНО-К1 в отношении одних и тех же антигенов не выявлено. Разнообразие вариантов влияния на жизнеспособность клеток-мишеней подтвердили опыты с использованием 3 образцов водно-солевых экстрактов различных штаммов B. pseudomallei, два из которых оказывали слабо выраженное цитопатогенное воздействие на клетки. Третий — водно-солевой экстракт B. pseudomallei51274. Этот антиген достоверно снижал показатели числа жизнеспособных клеток в популяциях L929 и СНО-К1 на 19 и 30 % соответственно (в случае применения дозировки, равной 0,7 МТД). Таким образом, выполненное исследование позволило получить новые данные о характере биологической активности использованных в работе соединений непосредственно на клеточном уровне. Апробирована клеточная модель для определения токсических свойств антигенов возбудителя мелиоидоза in vitro. Разработаны приоритетные варианты тестов цитотоксичности in vitro, которые могут найти применение в качестве дополнительного метода оценки: 1) потенциальных компонентов экспериментальных химических комплексных вакцин; 2) корректного выбора антигенного материала для воспроизведения различных схем иммунизации животных-продуцентов гипериммунных сывороток; 3) динамики накопления токсичных метаболитов в жидких питательных средах выращивания штаммов B. pseudomallei с различной вирулентностью для биомоделей; 4) при отборе штаммов-продуцентов токсичных биополимеров B. pseudomallei. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Области практического применения культур перевиваемых линий клеток для тестирования in vitro различных биополимеров постепенно расширяются [3, 9, 10]. В настоящее время преимущества определения цитотоксичности антигенов in vitro по сравнению с постановкой биопробы в части экономичности, универсальности, воспроизводимости, относительной простоты в исполнении не вызывают сомнения [2, 5, 8]. Однако сведения о применении клеточных моделей in vitro для изучения и оценки токсичности различных антигенных комплексов B.pseudomallei ограничены. Известно, что возбудитель мелиоидоза продуцирует ряд биологически активных соединений, в том числе токсинов, частично охарактеризованных, выявляемых чаще всего в жидких средах культивирования, входящих в группу соединений, отнесенных к факторам вирулентности и патогенности B.pseudomallei [6]. Изучение этих факторов во взаимодействии с клеткой в тестах in vitro — востребованное и актуальное направление исследований.

作者简介

N. Khrapova

Email: khrapovanp@gmail.com

E. Pimenova

L. Lomova

参考

补充文件