DEVELOPMENT AND VALIDATION OF ASSAY FOR KEMANTANE TABLETS BY GAS LIQUID CHROMATOGRAPHY

全文:

Кемантан (5-гидроксиадамнатан-2-он) по сво- В ФГБУ «НИИ фармакологии им. В. В Закусова» ей структуре представляет собой производное ада- РАМН была создана лекарственная форма кемантана- мантана, обладающее выраженной фармакологичес- таблетки дозировкой 100 мг. Ранее для количественного кой активностью. Показано, что кемантан обладает определения кемантана в таблетках применялся спектроантипаркинсоническим, иммунотропным действием, фотометрический метод [1]. Однако разработанная метоспособностью устранять алкогольный абстинентный дика обладала низкой чувствительностью и воспроизвосиндром, а также высокой цереброваскулярной ак- димостью, в связи с чем было принято решение о разративностью, усиливая кровоснабжение ишемизиро- ботке новой методики количественного определения с ванного мозга [2, 3]. помощью метода газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Выпуск 1 (49). 2014 97 ©SSTOpßS ©ôffiïff ЦЕЛЬ РАБОТЫ Разработать методику количественного определения кемантана в таблетках методом газо-жидкостной хроматографии и провести ее валидацию. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования являлись серийные образцы таблеток кемантана дозировкой 100 мг, разработанные и полученные в лаборатории технологии готовых лекарственных форм ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН. В качестве свидетелей использовали образцы субстанции кемантана, а также образцы технологических примесей кемантана: адамантан-2,6-дион и адамантан-2-он. В качестве внутреннего стандарта использовали 1 -адамантанэтанол (Aldrich Chem. Co.: CAS № 6240-11 -5). Методика количественного определения была разработана и валидирована на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором (Varian GC-450, Нидерланды) и автосамплером (Varian CombiPALAutosampler, Нидерланды). Обработку сигнала и полученных результатов осуществляли при помощи программы Galaxie (Galaxie Chromatography Data System, версия 1.9.302.952). Разделение проведено на кварцевой капиллярной колонке «CP-WAX 52СВ» длиной 50 м и внутренним диаметром 0,32 мм с нанесенной неподвижной фазой - полиэтиленгликолем (толщина слоя 1,2 мкм) (CP-WAX 52СВ, Varian, Нидерланды). В качестве растворителя для подготовки проб использовали спирт этиловый, 95%-й. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В результате проведенных исследований были выбраны следующие условия: температура испарителя - 220 оС, температура термостата-200 оС, температура детектора - 230 оС, скорость газа-носителя (азот) - 5 мл/мин, скорость газа-поддува (азот)-25 мл/мин, скорость водорода - 30 мл/мин, скорость воздуха - 300 мл/мин, деление потока-1:40, объем пробы-1 мкл. Анализ модельных смесей кемантана, технологических примесей и внутреннего стандарта с концентрацией каждого из соединений 0,5 мг/мл показал, что в выбранных условиях происходит полное разделение исследуемых соединений (рис. 1). На хроматограмме извлечения из плацебо, кроме пика растворителя, дополнительных пиков не наблюдалось. С целью выбора рабочей концентрации кеманта-на в испытуемых растворах нами была изучена зависимость площади пика от концентрации растворов кемантана и внутреннего стандарта (1-адамантанэтанола). Линейная зависимость и для растворов кемантана, и для растворов 1-адамантанэтанола, наблюдалась в интервале от 0,01 мг/мл до 1 мг/мл, значения коэффициентов корреляции составляли не менее 0,999 (рис. 2). Рис. 1. Хроматограмма модельной смеси кемантана, технологических примесей и внутреннего стандарта: I - адамантан-2-он, II - 1-адамантанэтанол, III - адамантан-2,6-дион, IV - кемантан Рис. 2. Зависимость площади пика от концентрации растворов кемантана (I) и 1-адамантанэтанола (II) Предел обнаружения кемантана - 0,00025 мкг, 1-адамантанэтанола - 0,000125 мкг. Предел количественного определения кемантана-0,00125 мкг, 1-ада-мантанэтанола - 0,00025 мкг. На основании полученных данных была выбрана рабочая концентрация для растворов кемантана и 1-адамантанэтанола (внутреннего стандарта) - 0,5 мг/мл. Определение полноты извлечения кемантана из таблеточной массы проводили на модельных смесях субстанции кемантана и плацебо с содержанием вспомогательных веществ, аналогичным содержанию в таблетке, и с содержанием кемантана (100 ± 20) % от номинального. Извлечение кемантана из таблеток проводили на ультразвуковой бане в течение 10 мин, к полученным пробам прибавляли раствор внутреннего стандарта, а затем фильтровали через фильтр «Мил-липор» с диаметром пор 0,45 мкм. Параллельно готовили раствор для расчета поправочного коэффициента с концентрацией кемантана и 1-адамантанэ-танола - 0,5 мг/мл. Полученные растворы хроматографировали, получая не менее 3 хроматограмм каждого раствора, результаты усредняли. 98 Выпуск 1 (49). 2014 Поправочный коэффициент вычисляли по следующей формуле: X = К = где Sst - площадь пика внутреннего стандарта, мВ х мин; SKjäM - площадь пика кемантана, мВ х мин; Cst - концентрация раствора внутреннего стандарта, мг/мл; Скем - концентрация раствора кемантана, мг/мл. Расчет содержания кемантана в модельном растворе (мг/мл) проводили по следующей формуле: где Sx - площадь пика кемантана в испытуемом растворе, мВ х мин; Sst - площадь пика внутреннего стандарта в испытуемом растворе, мВ х мин; Cst-концентрация внутреннего стандарта в испытуемом растворе, мг/мл; K-поправочный коэффициент. Полученные результаты представлены в табл. Результаты анализа модельных растворов показали, что относительная ошибка однократного опреде- Результаты количественного определения кемантана в модельных растворах методом ГЖ st st Взято кемантана, мг/мл Найдено, мг/мл Абсолютная ошибка однократного определения Относительная ошибка однократного определения, % Метрологические характеристики, Р. = 95 % Найдено в среднем, % Метрологические характеристики, Р. = 95 %, n = 9 0,405 0,414 0,416 0,404 0,404 +0,009 +0,011 - 0,001 - 0,001 2,22 2,72 0,25 0,25 X = 0,410 S = 0,0064 ЛХ = 0,0102 g = 2,49 % 101,23 X (%) = 100,65 S = 1,000825 Sx = 0,333608 0,427 0,429 +0,002 0,47 X = 0,429 100,47 ЛX = 0,77 % 0,428 0,431 +0,001 +0,004 0,23 0,94 S = 0,00153 ЛХ = 0,00380 g = 0,89 % g = 0,77 % 0,451 0,451 0 0 X = 0,455 100,89 0,455 +0,004 0,89 S = 0,0040 0,459 +0,008 1,77 лX = 0,00993 g = 2,18 % 0,475 0,480 +0,005 1,05 X = 0,477 100,42 0,475 0,476 0 +0,001 0 0,21 S = 0,00265 лX = 0,00380 g = 0,80 % 0,500 0,490 -0,010 2,00 X = 0,493 98,6 0,493 -0,007 1,40 S = 0,00351 0,497 -0,003 0,60 ЛX = 0,00871 g = 1,77 % 0,527 0,530 0,530 0,526 +0,003 +0,003 -0,001 0,57 0,57 0,19 X=0,529 S = 0,002345 Л X = 0,005822 g = 1,10 % 100,38 0,552 0,553 +0,001 0,18 X = 0,557 100,91 0,555 +0,003 0,54 S = 0,00529 0,563 +0,011 1,99 X 0,01313 g = 2,36 % 0,575 0,582 +0,007 1,22 X = 0,589 102,43 0,591 +0,016 2,78 S = 0,00586 0,593 +0,018 3,13 лX = 0,01455 g = 2,47 0,605 0,614 +0,009 1,49 X = 0,608 100,50 0,611 +0,006 0,99 S = 0,00568 0,602 0,604 -0,003 -0,001 0,50 0,17 лX = 0,00903 g = 1,49 % Выпуск 1 (49). 2014 99 ©SSTOpßS ©ôffiïff ления количественного содержания кемантана методом ГЖХ не превышает 2,72 %. Отклонение среднего результата измерения от истинного значения не превышало 2,43 %. Ошибка методики - 0,77 %. Разброс данных: (100,65 ± 0,77) %. Проверку пригодности хроматографической системы проводили путем хроматографирования раствора кемантана и 1 -адамантанэтанола с концентрацией каждого из соединений 0,5 мг/мл, по относительному времени удерживания пика кемантана относительно пика внутреннего стандарта 2,15 ± 0,02; числу теоретических тарелок (не менее 10000); фактору асимметрии (не более 2,0) и относительному стандартному отклонению площади пика кемантана (не более 2 %). Изменение температуры термостата в пределах ± 10 оС и скорости газа-носителя в пределах ± 0,5 мл/мин значительного влияния на разрешение и форму пиков исследуемых соединений не оказывало. Определение количественного содержания кемантана в таблетках было проведено на пяти серийных образцах. Испытуемые растворы готовили следующим образом: около 0,1 г (точная навеска) порошка растертых таблеток вносили в мерную колбу вместимостью 10 мл, добавляли 7 мл спирта этилового 95%-го и помещали на ультразвуковую баню на 10 минут. Затем объем раствора доводили до метки тем же растворителем и тщательно перемешивали. 1 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, куда предварительно вносили 5 мл спиртового раствора внутреннего стандарта (1-адамантанэта-нола) с концентрацией 1 мг/мл. Доводили объем раствора до метки тем же растворителем, перемешивали и фильтровали через фильтр «Миллипор» с диаметром пор 0,45 мкм (концентрация кемантана 0,5 мг/мл). Параллельно готовили раствор для расчета поправочного коэффициента. Получали не менее 5 хроматограмм каждого раствора. Формула расчета содержания кемантана в таблетках (г/табл.): X = К X S m V m где m , - средняя масса таблетки, г; m - m табл. г r-і > > навески масса навески таблеточной массы, г; S - площадь пика кемантана в испытуемом растворе, мВ X мин; Sst - площадь пика внутреннего стандарта в испытуемом растворе, мВ X мин; Cst - концентрация внутреннего стандарта в испытуемом растворе, мг/мл; V - объем разведения навески таблеточной массы, мл; K-коэффициент пересчета. Содержание кемантана в таблетках составляло от 0,0971 до 0,1042 г в таблетке. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, нами была разработана методика количественного определения кемантана в таблетках с помощью ГЖХ. Разработанная методика специфична и обладает высокой чувствительностью. На модельных смесях проведена оценка правильности, прецизионности и устойчивости методики. Показано, что извлечение кемантана из таблеточной массы происходит практически полностью, отклонение среднего результата измерения от истинного значения не превышает 2,7 %. Ошибка методики - 0,77 %. Изменение температуры термостата в пределах ± 10 оС и скорости газа-носителя в пределах ± 0,5 мл/мин значительного влияния на разрешение и форму пиков исследуемых соединений не оказывает. С помощью разработанной методики проведено количественное определение кемантана в таблетках. Показано, что качество таблеток по этому показателю соответствует требованиям Государственной Фармакопеи СССР XI издания.

作者简介

A. Tolkacheva

Email: avtolkacheva@rambler.ru

L. Grushevskaya

N. Avdyunina

B. Pyatin

L. Gaevaya

A. Miheeva

V. Prokofeva

E. Blinskaya

参考

补充文件