NFLUENCE OF LIMIDOL ON THE MORPHOLOGICAL FEATURES OF PANCREATIC ISLET APPARATUS IN ANIMALS WITH STREPTOZOTOCIN DIABETES

全文:

Известно, что структуры бензимидазола входят в состав некоторых лекарственных средств и биологически активных веществ, проявляющих различные виды фармакологической активности [11]. Одно из соединений этой группы - лимиглидол (лабораторный шифр РУ-254) [3] - гипогликемическое средство, усиливающее секрецию инсулина [4]. На основании ранее проведенных исследований установлено, что гипогликемический эффект этого соединения, обнаруженный на интактных животных и животных с аллок-сановым диабетом, связан с его поливалентным механизмом действия: усилением секреции инсулина [4], увеличением утилизации глюкозы периферическими тканями и пролонгацией гипогликемического эффекта инсулина [10]. То есть механизм гипогликеми-ческого действия лимиглидола определяется его панкреотропными и экстрапанкреотропными эффектами. Проведена третья фаза клинических испытаний, в которых была подтверждена гипогликемическая активность лимиглидола [2]. Были опубликованы данные о том, что это соединение является ингибитором ДПП-4 [5]. Установлено, что для всех ингибиторов ДПП-4 характерно влияние на регенерацию ß-клеток поджелудочной железы [9]. Исходя из вышеизложенного, представляется интересным проверить влияние препарата лимиглидола на регенерацию ß-клеток, при стрептозотоциновой интоксикации. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучить влияние соединения лимиглидола на ги-погликемическую активность и изменение островкового аппарата поджелудочной железы крыс после стрептозотоциновой интоксикации. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты проводили на 70 половозрелых нелинейных белых крысах самцах массой 250-300 г, содержащихся в условиях вивария с естественным световым режимом, на полноценном рационе. В работе использовали таблетированную лекарственную форму лимиглидола (дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2^]бензимидазола) 100мг («ОАО Акрихин», Россия; лаб. № 540213). Гипогликемическое действие изучали на животных со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом (стрептозотоцин 45 мг/кг, однократно в/в на цитратном буфере рН = 4,5) (Sigma, США) [1]. Гипогликемическое действие субстанции лимиглидола изучали при ежедневном введении животным внутрь в дозе 50 мг/кг в течение 28 дней. Уровень глюкозы в плазме крови оценивали с помощью набора «Глюкоза ФКД» (Россия) [7]. Динамику изменений уровня глюкозы в плазме крови крыс оценивали еженедельно. Тест толерантности к глюкозе проводили при пероральной нагрузке глюкозой (ч. д. а., «Экрос», Россия) в дозе 3 г/кг на 7, 14, 21 и 28-е сутки курсового введения. Перед началом эксперимента (за 12 ч) животным проводили пищевую депривацию со свободным доступом к воде. За 2 ч до проведения теста опытным животным перорально вводили исследуемое вещество (лимиглидол), контрольным группам крыс-дистиллированную воду в аналогичном объеме. Образцы крови для оценки гликемии забирали до введения препаратов, 62 Выпуск 1 (53). 2015 üosünpCs [ЩсшііПЩІ через 2 ч после введения препарата, через 30 минут после введения глюкозы и потом в течение 2 ч с 30-минутными интервалами. Уровень глюкозы определяли в цельной крови вышеуказанным способом. Скорость утилизации глюкозы оценивали исходя из степени снижения площади под кривой содержания «глюкоза - время» [6]. Данные обрабатывались статистически с использованием пакета программ «Statistica 6.0» (StatSoft, США). Для гистологического исследования ткань поджелудочной железы разделяли на три фрагмента - кишечный, желудочный и селезеночный. Полученный материал фиксировали в 10%-м растворе нейтрального за-буференного формалина (pH = 7,4) в течение 24 ч. На роторном микротоме изготавливали срезы толщиной 5-6 мкм и монтировали их на предметные стекла с поли-1_-лизином. Для обзорных целей микропрепараты окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятым гистологическим методикам [8]. Для выявления ß-эндокриноцитов островков Лан-герганса использовали первичные моноклональные антитела к инсулину [клон Ab-6 (INS04 + INS05), LabVision, Великобритания]. Иммуногистохимическое исследование проводили в соответствии с протоколами фирм производителей антител без предварительной демаскировки антигенов с использованием системы детекции «UltraVision» (LabVision, Великобритания) и хромогеном-диаминобензидином с докраской гематоксилином. Достоверность полученных результатов контролировали с помощью позитивных и негативных контролей антигенов, а также негативных контролей антител. В ходе иммуногистохимической реакции определяли удельное количество инсулин-позитивно окрашенных клеток по визуально-аналоговой шкале D. C. Allred, et al. (1998). Фотопротоколирование микроскопических изменений производили с использованием микроскопа «AxioScope» (CarlZeiss, Германия) и цифровой фотокамеры «PowerShot» (Canon, Япония). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В ходе эксперимента было выявлено, что изучаемое соединение оказывает выраженный гипоглике-мический эффект. При проведении теста толерантности к глюкозе на 7-й день было выявлено стойкое снижение уровня глюкозы в крови крыс со стрептозо-тоциновым СД, получавших лимиглидол, площадь под кривой уменьшалась на 34 % по сравнению с контрольной группой. Данная тенденция отмечалась на протяжении четырех недель эксперимента и на 28-й день достигла максимума, площадь под кривой снижалась на 47 % по сравнению с контрольной группой крыс с СД. Данные достоверно подтверждались показателем площади под кривой «глюкоза - время» (табл. и рис. 1). Рис. 1. Влияние лимиглидола в дозе 50 мг/кг (внутрь) на показатель теста углеводной нагрузки (3 г/кг) - площадь под кривой, у е. При морфологическом исследовании в контрольной интактной группе панкреатические островки во всех отделах поджелудочной железы имели округлую или слегка овальную форму и располагались поодиночке или группами из нескольких островков преимущественно рядом с внутридольковыми выводными протоками. Центральные отделы островков Лангерган-са состояли преимущественно из инсулин-позитивных клеток с накоплением в цитоплазме большого количества иммунопозитивного материала (рис. 2). Деструктивные и воспалительные изменения отсутствовали. При моделировании стрептозотоцин-индуцирован-ного СД в поджелудочной железе отмечалось незначительное полнокровие кровеносных капилляров, умеренная очаговая лимфогистиоцитарная инфильтрация островков - «инсулит», некробиотические изменения эндокриноцитов островков Лангерганса и умеренная гипертрофия ядер функционирующих ß-клеток. Панкреа Влияние лимиглидола в дозе 50 мг/кг на уровень глюкозы (ммоль/л) крыс со стрептозотоциновым экспериментальным диабетом, при пероральном тесте толерантности к глюкозе (3 г/кг) (28-й день), М ± m Группы животных Исход 90 мин 120 мин Площадь под кривой «Глюкоза-время», у. е. Интактные 3,52 ± 0,25 7,83 ± 0,18 6,92 ± 0,3 932,52 ± 186,60 Диабет 20,24 ± 0,97 24,49 ± 0,95* 23,66 ± 0,96* 2656,47 ± 210,91* Лимиглидол 13,75 ± 2,81 15,02 ± 3,01** 13,34 ± 2,7** 1610,59 ± 318,55** ^Достоверно по отношению к контролю, критерий Стьюдента (р > 0,05); "достоверно по отношению к группе с экспериментальным сахарным диабетом, критерий Стьюдента (р > 0,05). Выпуск 1 (53). 2015 63 ІШторСз тические островки имели округлую, овальную или неправильную форму. Иммунопозитивный материал располагался неравномерно, с преимущественным накоплением в единичных группах клеток панкреатических островков (рис. 2). Количество инсулин-позитивных клеток уменьшалось во всех отделах железы, а в отдельных островках инсулиноциты отсутствовали. При введении субстанции лимиглидола животным с моделью стрептозотоцин-индуцированного СД в поджелудочной железе отмечалась мозаичная морфологическая картина. Часть островков Лангерганса сохраняли округлую форму, часть были неправильной формы. В островках выявлялись явления умеренного полнокровия кровеносных капилляров с очаговой инфильтрацией островков лимфоцитами и гистиоцитами. Отмечалась выраженная гипертрофия ядер ß-эндокриноцитов. Визуализировались некробиотические изменения инсулиноци-тов (в отдельных островках вплоть до полного отсутствия). В некоторых островках сохранялись единичные разрозненные инсулин-позитивные клетки (рис. 2). Таким образом, на основании морфологического исследования можно сделать заключение, что развитие стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета сопровождается характерными патогистологическими изменениями островкового аппарата поджелудочной железы в виде воспаления (инсули-та), некробиоза инсулиноцитов и уменьшения количества ß-эндокриноцитов. ЗАКЛЮЧЕНИЕ На основании проведенных исследований установлено, что в условиях экспериментального сахарного диабета лимиглидол уменьшает содержание сахара в крови и статистически значимо снижает показатель-тест толерантности к глюкозе. При длительном введении препарата лимиглидола отмечается незначительное увеличение удельного количества ß-эндокриноци-тов в желудочном и кишечном отделах. Кроме того, лимиглидол препятствует развитию воспалительных и деструктивных изменений островкового аппарата под- Кишечный отдел (А) Желудочный отдел (Б) . »· \ * :■ , ,>·- Селезеночный отдел (В) ш Рис. 2. Распределение ß-клеток по панкреатическим островкам: I - интактный контроль, II - стрептозотоцин-индуцированный СД, III-А - стрептозотоцин-индуцированный СД + коррекция (единичные инсулин-позитивные клетки), III-Б - стрептозотоцин-индуцированный СД + субстанция. Первичные антитела к инсулину визуализация ДАБ с докраской гематоксилином. Начальное ув. х 400 64 Выпуск 1 (53). 2015 jDseunpGs [ЩішііПМЩ желудочной железы. Известно, что инкретиномимети-ческий эффект напрямую связан с увеличением ß-кле-ток поджелудочной железы [12]. Установлено, что вероятно для соединения лимиглидола периферический механизм гипогликемического действия не связан с влиянием на инкретины, так как не выявлено действие на пролиферацию ß-клеток. Обращает на себя внимание тот факт, что под влиянием лимиглидола отмечается выраженная гипертрофия ядер сохранившихся ß-эндокриноцитов. Эти данные совпадают с ранее проведенными исследованиями на интактных животных и являются косвенным доказательством инсулиногенного эффекта лимиглидола [4].

作者简介

A. Spasov

K. Lenskaya

Email: karinavl@yandex.ru

G. Snigur

参考

补充文件