IN VITRO АNTIAGGREGATЮN ACTIVITY OF NOVEL BENZIMIDAZOLE DERIVATIVES

全文:

Ключевая роль активации тромбоцитарно-сосуди- тромбоцитов - ацетилсалициловая кислота и блокато-стого гемостаза в патогенезе ишемических нарушений ры Р2^2-рецепторов-тиклопидин, клопидогрель, прав различных органах определяет целесообразность сугрель, тикангрелор, кангрелор [8, 10]. Эти препараты использования антиагрегантных средств и других ме- проявляют различные механизмы действия, однако тодов для их лечения и профилактики [5, 7, 11]. В на- основной точкой приложения для данных лекарствен-стоящее время эффективность антитромбоцитарной ных средств является стадия необратимой агрегации. терапии доказана в хорошо спланированных клиничес- Необходимо отметить также, что эти препараты обла-ких исследованиях, продемонстрировавших, что дли- дают недостатками, к которым относится позднее тельный прием антитромбогенных средств снижает риск наступление основного терапевтического эффекта, по-сосудистых эпизодов [9]. Наиболее широкое примене- вышение риска кровотечений различного генеза, тром-ние в клинической практике нашли антиагрегантные пре- боцитопения, нейтропения, аллергические реакции, а так-параты, относящиеся к ингибиторам циклооксигеназы же развитие резистентности при длительных курсах Выпуск 1 (53). 2015 89 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ лечения [4]. Это объясняет актуальность выявления и изучения новых соединений с антиагрегантной активностью. Как показали ранее проведенные исследования биологической активности производных бензими-дазола в Волгоградском государственном медицинском университете, отдельные производные данного класса проявляют выраженную антиагрегантную активность [1, 2]. Поэтому нам представилось интересным изучить способность новых производных этой трициклической системы, оказывать влияние на тромбогенный потенциал крови. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучить антиагрегантную активность новых производных бензимидазола на модели АДФ-индуцирован-ной агрегации тромбоцитов in vitro. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ В данной работе проведено экспериментальное исследование влияния 16 новых производных бензимидазола под шифром ДАБ [НИИ ФОХ ЮФУ] на процессы агрегации тромбоцитов in vitro. Эксперименты выполнены на 9 кроликах, весом 3,0-3,5 кг. Острая токсичность определялась на 75 белых нелинейных мышах-самцах массой 20-22 г при внутрибрюшинном введении. Исследования проводили согласно методическим руководствам и нормативным документам (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96; правилам и Международным рекомендациям Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997); правилам лабораторной практики (GLP) в Российской Федерации, утвержденным приказом Минздрава РФ от 19 июня 2003 г. № 267). Животные содержались в условиях вивария (температура 22-24 °С, относительная влажность воздуха 40-50 %) с естественным световым режимом на стандартной диете (ГОСТ Р 50258-92), с соблюдением правил качественной лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 1000.4-96), а также правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). В течение 24 ч до экспериментов животные находились в условиях полной пищевой депривации со свободным доступом к воде. На момент проведения исследований все животные были здоровыми, без изменений поведения, режима сна и бодрствования, аппетита. Для исследования была выбрана модель АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов по методу G. Born, в модификации В. А. Габбасова, воспроизведенная на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов «Биола» 220 LA (Россия) [13]. Для приготовления богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин, после чего верхний слой плазмы переносили в другую пробирку, а остаток повторно цент рифугировали в течение 15 мин при 3000 об./мин для получения плазмы, бедной тромбоцитами. В качестве индуктора агрегации использовали аденозин-5-дифос-форную кислоту (АДФ) («Serva», Венгрия), в конечной концентрации 5 мкМ. Соединения и препараты сравнения ацетилсалициловая кислота («Sigma», США) и тиклид («Sanofi-syntelabo», Франция) in vitro изучались в концентрации 100 мкМ. Уровень агрегации оценивался по значению степени агрегации, определяемой как максимальное приращение светопропускания после добавления индуктора. Для оценки активности соединений определяли Δ % ингибирования функциональной активности тромбоцитов. Для расчета индекса EC50 (эффективная концентрация, подавляющая процесс агрегации тромбоцитов на 50 %), который проводили с использованием метода регрессионного анализа, вещества изучались в концентрации 100, 10 и 1 мкМ. Исследование токсичности наиболее активных соединений выполнялось в соответствии с требованиями и инструкциями Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития [6]. Острая токсичность определялась на 65 белых нелинейных мышах-самцах массой 20-22 г при внутрибрю-шинном введении. Гибель животных регистрировалась в течение двух недель. Величину токсикологического показателя - LD50 рассчитывали по методу Личфилда-Вилкоксона. Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась с использованием критерия Манна-Уитни при помощи пакета статистических программ программного обеспечения Microsoft Excell 2006. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В результате исследования было показано, что новые производные бензимидазола оказывают анти-агрегантный эффект in vitro в различной степени выраженности. При исследовании соединений в концентрации 100 мкМ было установлено выраженное антиагрега-ционное действия у соединений под шифрами ДАБ-4, ДАБ-7, ДАБ-9, ДАБ-12, ДАБ-13, ДАБ-14, ДАБ-15, ДАБ-25 и ДАБ-26. Ингибирование агрегации тромбоцитов под влиянием этих соединений превышало 50 %. При этом вещества ДАБ-13, ДАБ-14 и ДАБ-15 по своей активности достоверно превосходили препарат сравнения ацетилсалициловую кислоту и оказывали эффект, сравнимый с эффектом тиклида. По антиагрегантной активности соединения ДАБ-7, ДАБ-12, ДАБ-20, ДАБ-21 ДАБ-22 и ДАБ-24 были сопоставимы друг с другом и c ацетилсалициловой кислотой, однако уступали тикпиду. Соединения ДАБ-5, ДАБ-8 и ДАБ-23 оказали самую низкую антитромбо-цитарную активность, ингибируя агрегацию тромбоцитов в концентрации 100 мкМ на 32,00, 40,29 и 40,99 % соответственно (табл. 1). 90 Выпуск 1 (53). 2015 jDseunpGs [ЩішііПМЩ Таблица 1 Влияние новых производных бензимидазола в концентрации 100 мкМ, ацетилсалициловой кислоты (АСК) и тиклида на АДФ-индуцированную (5 мкМ) агрегацию тромбоцитов (М ± m) № п/п Шифр соединения Ингибирование агрегации тромбоцитов Δ % (М ± m) в концентрации 100 мкМ 1 ДАБ-4 72,16 ± 6,40*# 2 ДАБ-5 32,8 ± 3,20* 3 ДАБ-7 54,33 ± 3,70* 4 ДАБ-8 40,29 ± 4,30* 5 ДАБ-9 69,84 ± 3,10*# 6 ДАБ-12 50,83 ± 5,30* 7 ДАБ-13 81,57 ± 7,40*# 8 ДАБ-14 87,33 ± 8,30*# 9 ДАБ-15 81,21 ± 4,10*# 10 ДАБ-20 44,52 ± 3,80* 11 ДАБ-21 47,66 ± 7,10* 12 ДАБ-22 49,27 ± 5,90* 13 ДАБ-23 40,99 ± 4,40* 14 ДАБ-24 46,58 ± 4,10* 15 ДАБ-25 59,54 ± 8,50* 16 ДАБ-26 50,96 ± 5,30* 17 АСК 52,06 ± 4,20* 18 Тиклид 80,9 ± 2,70* *р < 0,05 - изменения статистически достоверны по сравнению с исходными показателями; #изменения статистически достоверны по сравнению с АСК. Исследование влияния наиболее активных веществ на агрегацию тромбоцитов в диапазоне концентраций от 1 до 100 мкМ выявило дозозависимый эффект, в результате которого 8 из 16 изученных соединений по эффективной концентрации (IC50) превосходили препарат сравнения ацетилсалициловую кислоту. При этом вещества под шифрами ДАБ-13, ДАБ-14 и ДАБ-15 проявили наибольшую антиагрегантную активность in vitro, превосходя ацетилсалициловую кислоту в 57, 58 и 65 раз соответственно. Однако при этом данные соединения уступали другому препарату сравнения тиклопидину в 1,8, 1,7 и 1,5 раза соответственно (табл. 2). Далее была изучена острая токсичность трех наиболее активных соединений под шифрами ДАБ-13, ДАБ-14 и ДАБ-15. Соединение ДАБ-13 в дозировке 100 мг/кг вызывало летальный исход у 100 % подопытных животных. LD50 веществ под шифрами ДАБ-14 и ДАБ-15 составила 113 и 115 мг/кг соответственно, и для них был рассчитан условный терапевтический индекс (УТИ) (табл. 3). Таким образом, соединения ДАБ-14 и ДАБ-15 по УТИ превосходят ацетилсалициловую кислоту в 2,4 и 3,4 раза соответственно, однако в 6,2 и 4,4 раза уступают тиклиду. Далее была изучена зависимость антиагрегантного действия новых производных бензимидазола от их химической структуры. Так как в целом все изученные вещества ингибировали АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов in vitro и отличались лишь по степени выраженности эффекта, можно предположить, что в антиагрегантную активность данного класса вносит положительное влияние базовая структура. Анализ влияния заместителей на высокий уровень антиагрегантной активности новых производных бензи-мидазола производился для заместителей в положении 1. В группе веществ, относящихся к данному ряду соединений, значимый вклад в антиагрегантную активность, по-видимому, вносят метоксифеноксиэтильный и фторбензильный заместители. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате изучения 16 новых производных бензимидазола на предмет ингибирования агрегации тром- Таблица2 Эффективная концентрация (ЭК50) производных бензимидазола (М ± m) № п/п Шифр соединения Δ % ингибирования агрегации тромбоцитов (по трем опытам) в концентрациях: ЕC 50, М 100 мкМ 10 мкМ 1 мкМ 1 ДАБ-4 72,16 ± 6,4*# 39,5 ± 3,1*# 30,9 ± 4,9*# 1,3 х 10'э 2 ДАБ-7 54,33 ± 3,7* 31,55* 21,25*# 7,3 х 10'э 3 ДАБ-9 69,84 ± 3,1*# 33,18 ± 6,2* 24,26 ± 3,1*# 2,14 х 10'э 4 ДАБ-12 50,83 ± 5,3* 30,42 ± 4,3* 20,5 ± 2,9*# 1,15 х 10'э 5 ДАБ-13 81,57 ± 7,4*# 41,72 ± 2,1*# 37,13 ± 4,6*# 7,0 х 10'6 6 ДАБ-14 87,33 ± 8,3*# 44,3 ± 5,1*# 32,18 ± 4,2*# 6,8 х 10'6 7 ДАБ-15 81,21 ± 4,1*# 48,06 ± 3,6*# 35,43 ± 5,3*# 6,1 х 10'6 8 ДАБ-25 59,54 ± 8,5* 46,74 ± 3,1*# 32,25 ± 4,8*# 1,9 х 10'э 9 ДАБ-26 50,96 ± 5,3* 38,35 ± 2,9*# 34,75 ± 3,6*# 1,2 х 10'4 10 АСК 52,06 ± 4,2* 20,8 ± 3,5* 4,6 ± 1,7 1,04 х 10'4 11 Тиклид 80,9 ± 2,7* 55,7 ± 1,2* 39,04 ± 1,2* 3,9 х 10'6 *р < 0,05, изменения статистически значимы по отношению к контролю, критерий Манна-Уитни; #р < 0,05, изменения статистически значимы по отношению к эффекту препарата сравнения ацетилсалициловой кислоты. Выпуск 1 (53). 2015 91 ІШторСз Таблица 3 Антиагрегантная активность (ЭК50), величина острой суточной токсичности (ЛД50), и терапевтический индекс (УТИ) соединений ДАБ-14 , ДАБ-15, ацетилсалициловой кислоты (АСК) и тиклида № п/п Шифр соединения ЕС50, M LD50, мг/кг УТИ LD5o/EC5o 1 ДАБ-14 6,8 х 10'6 113 39,78 2 ДАБ-15 6,1 х 10'6 115 56,9 3 АСК 1,04 х 10'4 310 16,9 4 Тиклид 3,9 х 10'6 300 250,0 боцитов in vitro показано, что данный подкласс является перспективным для изучения данного вида активности. Были найдены высокоактивные соединения под шифрами ДАБ-14 и ДАБ-15, которые по условному терапевтическому индексу превосходят препарат сравнения ацетилсалициловую кислоту в 2,4 и 3,4 раза соответственно, что свидетельствует о целесообразности дальнейшего более углубленного фармакологического изучения данных соединений.

作者简介

A. Kucheryavenko

Email: aidakucheryavenko@yandex.ru

V Sirotenko

K. Gaydukova

D. Matokhin

A. Spasov

L. Divaeva

A. Morkovnik

T. Kuzmenko

V. Anisimova

参考

补充文件