CORNEAL SATURATION WITH RIBOFLAVIN DURING CORNEAL CROSS-LINKING OF COLLAGEN

Full Text

Кератоконус является прогрессирующим, невоспалительным, двусторонним (но обычно асимметричным) заболеванием роговицы, которое характеризуется истончением, ослаблением и эктазией ее параакси-альных зон, что приводит к искажению роговичной поверхности [6, 9]. Наиболее востребованным способом лечения на начальных стадиях заболевания является кросслинкинг роговичного коллагена (КРК), предложенный в конце 90-х годов ХХ в. группой авторов из Дрезденского Университета [10-14]. «Минусами» классической методики КРК, выполняемой по так называемому «Дрезденскому протоколу», являются: 1) длительный болевой синдром в раннем послеоперационном периоде; 2) риск развития инфекционных кератитов за счет нарушения эпителиального барьера роговицы; 3) различные нарушения процесса реэпителизации (замедление реэпителизации, гипертрофия эпителия, длительная эпителиопатия и т. д.), что приводит к длительному снижению работоспособности, увеличению числа случаев непереносимости контактной коррекции у данной категории пациентов в дальнейшем; 4) отсутствие возможности проведения КРК у пациентов с толщиной роговицы менее 400 мкм, вследствие возможного проявления цитотоксического эффекта УФ-излу-чения на эндотелий роговицы. По настоящее время исследователями ведется поиск возможных путей усовершенствования классичес кой методики КРК, чтобы улучшить переносимость ее пациентами, повысить ее эффективность [1-3, 7, 8]. С 2014 г. в Клинике Волгоградского филиала ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С. Н. Федорова», помимо классической, проводится методика кросслинкинга роговичного коллагена с дозированной эксимерлазерной деэпителизацией, выполняемой на глубину эпителиального слоя по данным оптической когерентной томографии (ОКТ) роговицы под контролем интраоперационной on-line пахиметрии [4, 5]. Также оптимизирован этап насыщения роговицы раствором «Дек-стралинк» путем использования для насыщения пластиковой воронки, устанавливаемой на поверхность глазного яблока. Одним из условий, обеспечивающих безопасность проведения операции КРК, является достижение достаточного уровня насыщения роговицы раствором рибофлавина. В данном исследовании использовались фотометрический метод определения концентрации растворов, колориметрический метод оценки насыщения роговицы раствором «Декстралинк», а также гистологический метод [14, 15]. Фотометрический метод основан на сравнении поглощения при пропускании света через себя стандартным и исследуемым растворами (в данном случае раствором рибофлавина), колориметрический анализ основан на оценке цветовых компонентов - красного, зеленого и синего-фотоизображений роговиц, Выпуск 1 (61). 2017 87 ЩШгорСз подвергнутых как стандартной, так и модифицированной методике кросслинкинга роговичного коллагена. Гистологический метод исследования позволяет оценить состояние эпителиального слоя роговицы при окраске гематоксилин-эозином и состояние стромальных коллагеновых волокон при окраске по Ван Гизон. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Оценить достаточность насыщения роговицы раствором «Декстралинк» с помощью колориметрического анализа, а также с помощью гистологического метода при выполнении модифицированной методики кросслинкинга роговичного коллагена в сравнении со стандартной методикой. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование проводилось на 20 свиных када-верных глазах (давность забора - 2 часа). Кадаверные глаза были распределены в 2 группы: 1 -я группа (10 глаз) - глаза, подвергшиеся стандартной методике КРК; 2-я группа (10 глаз) - глаза, подвергшиеся модифицированной методике КРК. В ходе эксперимента каждый глаз помещали в держатель, для создания необходимого уровня тургора глазного яблока (рис. 1), после чего в 1-й группе эпителий удаляли механически в центральной оптической зоне диаметром 8 мм, во 2-й группе проводили точечную эксимерлазерную абляцию с использованием описанного инструмента на глубину эпителиального слоя (50 мкм), под контролем интраоперационной on-line па-химетрии (опция эксимерного лазера «Schwind - Amaris 500») (рис. 2А, 2Б). Рис. 1. Фото кадаверного свиного глаза, закрепленного в держателе Далее, в обеих группах на поверхность глазного яблока устанавливалась пластиковая воронка, которую заполняли 1,0 мл раствора «Декстралинк» (рис. 3). Продолжительность этапа насыщения составила 15 мин во всех случаях. А Б Рис. 2 (А, Б). Фото роговиц кадаверных глаз после проведения точечной эксимерлазерной деэпителизации Рис. 3. Фото кадаверного глаза с установленной пластиковой воронкой на поверхности Для проведения колориметрического анализа роговицы кадаверных глаз, принимавших участие в эксперименте, были изолированы. Колориметрический анализ насыщения роговицы раствором рибофлавина 88 Выпуск 1 (61). 2017 üssmpfä 1)<§тППЩ| проводили по системе RGB (red, green, blue) с помощью программы Колориметр Digital Color версии 5.10 операционной системы OS X Capitan (10.11.2). Для исключения фотоизображений с различным уровнем яркости и освещенности проводили фоторегистрацию одновременно сразу двух исследуемых изолированных роговиц, расположенных рядом относительно друг друга, после их насыщения раствором рибофлавина при выполнении операции КРК по стандартной и по модифицированной методикам, а также исследовалась интактная роговица, не окрашенная раствором рибофлавина (контрольная группа). В каждой группе было по 10 кадаверных свиных глаз. Колориметрический анализ каждого глаза проводился трижды в оптической зоне роговицы с определением средних значений показателей RGB. По окончании колориметрического анализа изолированные роговицы погружали в раствор формалина для приготовления препаратов и проведения дальнейшего гистологического исследования. Срезы окрашивались гематоксилин-эозином для оценки толщины и состояния клеток переднего эпителия роговицы, а также по Ван Гизон для визуализации плотности и ориентации коллагеновых волокон в строме роговицы. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты фотоколориметрического анализа представлены в табл. Средние значения показателей RGB после насыщения роговицы раствором рибофлавина при стандартной и модифицированной методиках (10 глаз) Методика кросслинкинга роговичного коллагена Методика кросслинкинга роговичного коллагена Показатели RGB R G B M ±m M ±m M ±m Стандартная 157,3 1,4 123,5 2,5 46,3 1,3 Модифициро ванная 157,5 1,9 127,4 2,4 48,1 1,8 t 0,08 1,1 0,8 Р. >0,05 >0,05 >0,05 явления отека, инфильтрации ткани. Отмечено повсеместное разобщение пучков коллагеновых волокон, появление лакунарных пространств между ними и нарушение ориентации соединительнотканных пластинок. Пропитывание стромы роговицы рибофлавином привело к увеличению толщины оптического среза (рис. 5). Рис. 4. Результаты одного измерения насыщения роговицы раствором рибофлавина по системе RGB Рис. 5. Роговица свиньи, первая опытная группа, окраска гематоксилин-эозин, об. х 10 В препаратах роговицы из 1-й группы, окрашенных по Ван Гизон, наблюдается сохранение боумено-вой мембраны, в строме - повсеместное разобщение пучков коллагеновых волокон, появление лакунарных пространств между ними и нарушение ориентации соединительнотканных пластинок (рис. 6). Из таблицы видно, что различие между средними значениями колориметрических показателей R, G, B статистически недостоверны (t < 2,0; p > 0,05). Полученные результаты свидетельствуют о равноценной насыщаемости роговицы раствором рибофлавина, как по стандартной, так и по модифицированной методике. На рис. 4 в качестве примера представлены результаты одного измерения насыщения роговицы раствором рибофлавина по системе RGB. При оценке результатов гистологического исследования было установлено, что в первой опытной группе после полной механической деэпителизации местами в препарате, окрашенном гематоксилин-эозином наблюдалось разрушение боуменовой оболочки с обнажением стромы роговицы. В строме наблюдались Рис. 6. Роговица свиньи, первая опытная группа, окраска по Ван Гизон, об. х 10 Выпуск 1 (61). 2017 89 Шєтрій ©шгГІМЩ Во второй опытной группе, где проводилась точечная эксимерлазерная деэпителизация на глубину эпителиального слоя, при окраске гематоксилин-эозином отмечены участки десквамации переднего эпителия роговицы и частичного прерывания боуменовой мембраны. При этом соседние с участками слущива-ния кератоциты не пострадали и сохранили слоистость строения от рядов кубических до плоских клеток без элементов ороговения (рис. 7). При окраске по Ван Гизон видно, что такие участки деэпителизации дали возможность пройти рибофлавину в строму роговицы на всю ее глубину, что отразилось в появлении лакунарных пространств на всей площади поперечного среза роговицы до десцеметовой мембраны. Коллагеновые волокна при этом сохранили однонаправленность ориентации параллельно поверхности роговицы (рис. 8). Рис. 7. Роговица свиньи, вторая опытная группа, окраска гематоксилин-эозин, об. х 10 Рис. 8. Роговица свиньи, вторая опытная группа, окраска по Ван Гизон, об. х 10 Таким образом, результаты экспериментального этапа работы подтвердили одинаковое проникновение рибофлавина в строму роговицы как при проведении стандартной, так и модифицированной методики КРК. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Фотоколориметрический анализ свидетельствует о равноценной насыщаемости роговицы раствором ри бофлавина, как по стандартной, так и по модифицированной методике. Гистологические исследования показали возникновение изменений в виде появления лакунарных пространств и упорядочивания расположения коллагеновых волокон в строме роговиц на равной глубине в обеих группах, что также подтверждает наличие достаточной сравнимой глубины эффекта кросслинкинга роговичного коллагена при выполнении как стандартной, так и модифицированной методики.

About the authors

V. P Fokin

Volgograd Affiliate of the Federal State Autonomous Institution «The S.N. Fyodorov Eye Microsurgery Complex» of the Ministry of Public Health of the Russian Federation

E. G Solodkova

Volgograd Affiliate of the Federal State Autonomous Institution «The S.N. Fyodorov Eye Microsurgery Complex» of the Ministry of Public Health of the Russian Federation

Email: solo23@mail.ru

S. V Balalin

Volgograd Affiliate of the Federal State Autonomous Institution «The S.N. Fyodorov Eye Microsurgery Complex» of the Ministry of Public Health of the Russian Federation

V. L Zagrebin

Volgograd State Medical University

References

Supplementary files