A METHOD FOR QUANTIFICATION OF PLASMA CONCENTRATIONS OF METHYLDOPA

全文:

Methyldopa, HPLC-MS/MS, plasma, stabilization, pharmacokinetics. Метилдопа (МД) - антигипертензивное средство центрального действия. Его активный метаболит, а-ме-тилнорадреналин, является агонистом центральных пресинаптических а2-адренорецепторов. Согласно международным и отечественным рекомендациям данный препарат относится к первой линии лекарственных средств для лечения гипертонии беременных [1, 3]. Существуют методики количественного определения метилдопы в плазме крови с использованием ВЭЖХ с флюориметрическим [2, 3] и масс-спектрометрическим [1, 4] детектированием, недостатками которых являются длительная пробоподготовка с применением жидкостно-жидкостной экстракции [1, 2, 3] и низкая чувствительность [4]. Также авторами не указан используемый стабилизатор: хорошо известно, что двухатомные фенольные соединения легко окисляются в процессе хранения биологических жидкостей [5]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Разработка новой экспрессной методики количественного определения метилдопы в плазме для проведения исследования биоэквивалентности, обеспечивающей стабильность определямого вещества при хранении и в ходе выполнения аналитических процедур. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве стандартного образца определяемого вещества была использована метилдопа сесквигидрат (Teva Pharmaceuticals, Израиль), в качестве внутреннего стандарта й,1-Метилдопа-й3 (МД- D3) (TLC РІ^та Chem, Канада) (рис. 1). Работа выполнена с использованием ВЭЖХ-МС/ МС-системы Shimadzu, оснащенной двумя насосами LC-20AD, автосемплером SIL-20AC с устройством подачей проб Rack Changer II, термостатом колонок СТО-20AC с интегрированным 6-портовым краном FCV-32AH и трехквадрупольным масс-спектрометрическим детектором LCMS-8050. В качестве раствора стабилизатора применялся водный раствор, содержащий аскорбиновую кислоту в концентрации 50 мг/мл, натрия сульфит - 2 мг/мл, O O HO HO А Б Рис. 1. Структурные формулы метилдопы (А) и внутреннего стандарта - дейтерированной метилдопы (Б) Выпуск 3 (63). 2017 105 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ натрия гидрокарбонат - 24 мг/мл. Модельные смеси готовились путем прибавления к 950 мкл бланковой плазмы 50 мкл растворов МД в метаноле. Затем к валида-ционным образцам добавлялся раствор стабилизатора из расчета 0,2 мл раствора стабилизатора на 1 мл плазмы. При этом концентрации аналита в калибровочных образцах составили 0,02; 0,10; 0,25; 1,00; 1,50; 2,00; 2,50; 3,00 мкг/мл; в образцах КК - 0,02; 0,06; 0,30; 1,20; 2,40; 3,00 мкг/мл. При пробоподготовке аликвоту плазмы 100 мкл подвергали депротеинизации 400 мкл раствора МД^3 0,125 мкг/мл в метаноле, полученную смесь встряхивали на вортексе в течение 30 с при частоте 2400 мин-1, подвергали центрифугированию в течение 10 мин при 3500 об./мин и температуре +4 оС. Затем надосадочную жидкость вводили в хроматографическую систему. Для хроматографического разделения компонентов биологической пробы использовались две хроматографические колонки Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl (50 x 3,0 мм, 5 мкм) и Phenomenex Synergi Fusion - RP 80 (150 x 3,0 мм, 4 мкм). Элюирование проводили в изократическом режиме с применением подвижной фазы (ПФ) на основе метанола, воды и водного раствора формиата аммония в концентрации 80 ммоль/л. Масс-спектрометрической детектирование проводилось с применением электрораспылительной ионизации в режиме регистрации положительных ионов по следующим MRM-переходам: для МД - 211,95 ^ 138,90 m/z; для МД^3 - 214,95 ^ 169,00 m/z. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование стабильности метилдопы в плазме крови. Предварительная оценка стабильности метилдопы в плазме крови проводилась на модельных смесях с концентрацией 3 мкг/мл без добавления и с добавлением раствора стабилизатора при комнатной температуре и при замораживании до температуры -20 оС (рис. 2, табл. 1). В качестве антикоагулянта был использован К3ЭДТА. )_ ... 5 ^ 10 ^ 15 . 20 2> J0 Комн.темп. оез стао. * комн. темп, со стао. А Темп, яе вкптте -20°С беч стяб. )( Темп ие теьптте -20°С со стяб Рис. 2. Стабильность метилдопы в плазме крови при комнатной температуре и при замораживании до температуры не выше -20 оС Таблица 1 Предварительная оценка стабильности метилдопы в плазме крови при комнатной температуре и при замораживании Комнатная температура Время, ч концентрация, % от исходного уровня без добавления стабилизатора с добавлением стабилизатора 0 100,0 100,0 2,5 77,6 97,1 6 55,1 95,2 12 29,9 93,8 Температура не выше -20 °С 0 100,0 100,0 16 84,0 99,7 24 80,0 100,2 36 77,3 101,9 Таким образом, без стабилизатора метилдопа разлагается: при комнатной температуре за 2,5 часа окисляется 20,4 % от исходного количества лекарственного вещества, а при температуре - 20 оС за 24 часа -22,7 %, что не укладывается в критерии приемлемости (концентрация должна быть в диапазоне 85-115 % от исходной). Добавление раствора аскорбиновой кислоты с натрия сульфитом и гидрокарбонатом к плазме значительно замедлило процесс деградации. Валидация методики. Валидация разработанной методики была проведена в соответствии с требованиями руководства EMEA [6], Решения Совета Евразийской экономической комиссии № 85 «Об утверждении Правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза» [7]. Все испытания выполнены с добавлением стабилизатора. Полученные результаты валидационных тестов представлены в таблице 2. Исследование фармакокинетики метилдопы в форме таблеток, покрытых оболочкой. Разработанная методика прошла апробацию при исследовании фармакокинетики таблеток, покрытых оболочкой в дозировке 250 мг (препарат «Допегит» производства ОАО «Фармацевтический завод ЭГИС», Венгрия, серия D358N1014), которое было проведено на 12 здоровых добровольцах. Отбор образцов крови осуществлялся до приема препарата и через 5 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 1 ч, 1 ч 15 мин, 1 ч 30 мин, 1 ч 45 мин, 2 ч, 2 ч 15 мин, 2 ч 30 мин, 3 ч, 4 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 18 ч, 24 ч. Затем образцы крови, не позднее 15 мин после отбора, центрифугировали при температуре +4 оС в течение 5 мин при 3000 об./мин. После этого к полученной плазме добавлялся раствор стабилизатора из расчета 0,2 мл раствора стабилизатора на 1 мл плазмы. Полученные образцы хранились при температуре не выше -20 оС до проведения анализа. Расчет значений основных фармакокинетических параметров осуществлялся с помощью программ Microsoft Excel 2007, StatSoft STATISTICA v. 12 и пакета R, модуль Bear (Lee, Hsin-ya and Lee, Yung-jin, bear: Data Analysis Tool for Average Bioequivalence and Bioavailability) (рис. 4, табл. 3). 106 Выпуск 3 (63). 2017 (ЩагтрИа [ЩсатпГІМЩ Таблица 2 Валидационные характеристики разработанной методики Валидационный параметр Результаты Селективность Анализ 6 образцов бланковой плазмы крови (полученной из разных источников) и плазмы, содержащей определяемые вещества, показал, что интерференция в области времен удерживания МД не превышала 20 % от уровня НПКО, а в области времен удерживания МД- D3 не превышала 5 % от их концентрации (рис. 3) Нижний предел количественного определения (НПКО) 0,02 мкг/мл (точность 104,20 % от теоретической, прецизионность (CV*) -1,59 %) Линейность Диапазон концентраций: 0,02-3,00 мкг/мл. Коэффициент корреляции 8-точечной калибровочной кривой (г): 0,99772 до 0,99926 Прецизионность и точность Точность: от 94,72 % до 107,42 %; CV: от 0,69 % до 3,97 % Степень извлечения 63,49 % Отсутствия влияния разведения (двукратное разведение образцов с концентрацией аналита 4800 нг/мл) 100,21 % (при n = 6), CV = 1,78 %. Эффект влияния матрицы NMF** находился в диапазоне от 1,010 до 1,018; С^ от 0,40 до 1,27 % Стабильность Краткосрочная (24 ч) 95,50 % от номинальной концентрации Долгосрочная (29 дней) 90,74 % от номинальной концентрации При замораживании/размораживании 104,43 % от номинальной концентрации *Коэффициент вариации; ^нормализованный фактор матрицы. МД - m/z - 211,95 ^ 138,90 МД-Dß - m/z - 214,95 ^ 169,00 А Б Рис. 3. Хроматограммы бланковой плазмы (А) и калибровочного образца МД в концентрации 0,02 мкг/мл (НПКО) (Б) Таким образом, уровень максимальной концент- (0,02 мкг/мл) ниже, чем 5 % от Cmax, и чувствительнорации метилдопы в плазме крови составил 1,375 мкг/ сти методики достаточно для изучения биоэквивалентмл (табл. 3), следовательно, выбранное значение НПКО ности ее таблетированных форм [6, 7]. Соотношение Выпуск 3 (63). 2017 107 О 5 10 15 20 Время,ч Рис. 4. Усредненный фармакокинетический профиль концентрации метилдопы в плазме крови добровольцев после однократного приема таблеток «Допегит» в дозировке 250 мг Таблица 3 Значения фармакокинетических параметров метилдопы Cmax, мкг/мл Ч AUC0-t, мкг • ч/мл AUC0-„, мкг • ч/мл AUCat / AUC0-„, % Cmax/AUC0-t, ч Kel, ч-1 Т1/2, ч MRT, ч Ср. знач. 1,375 ± 2,75 ± 6,854 ± 7,008 ± 97,65 ± 0,202 ± 0,18 ± 4,848 ± 5,046 ± ± SD 0,491 0,805 2,262 2,288 1,05 0,033 0,095 2,186 0,583 Min 0,594 1,500 2,901 2,980 95,46 0,163 0,087 2,070 3,890 Max 2,275 4,000 9,490 9,775 99,26 0,268 0,335 8,010 5,730 CV, % 35,69 29,27 33,00 32,64 1,07 16,10 52,55 45,09 11,55 Примечание. Cmax - максимальная концентрация МД в крови; Tmax - время наступления максимальной концентрации препарата; Cmax/AUC - относительная скорость всасывания;Т1/2 - период полувыведения; AUC0-t - площадь под фармакокинетической кривой «концентрация - время» от нулевого значения времени до последнего отбора крови; AUC0-œ - площадь под фармакокинетической кривой от нулевого значения времени до бесконечности; Ke| - константа элиминации; MRT - среднее время удержания в крови. AUC0-t /AUC0_œ равнялось 97,65 %, что указывает на достаточную длительность наблюдения. Полученные значения ФК параметров практически совпадают с данными K. Rona, et al. [2], однако в 1,5 раза выше чем значения ФК параметров, рассчитанные в исследовании H. Valizadeh, et al. [3] за исключением периода полувыведения - он в 2,5 раза короче. Это может быть связано с тем, что после отбора образцов крови к плазме не был добавлен стабилизатор, и МД подверглась частичной деградации. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. Выбранные условия пробоподготовки, хроматографического разделения и масс-спектрометрического детектирования позволяют быстро и точно определять концентрацию метилдопы в плазме крови в диапазоне 0,02-3,00 мкг/мл 2. Использованный раствор стабилизатора-антиоксиданта, содержащий аскорбинововую кислоту в концентрации 50 мг/мл, натрия сульфит - 2 мг/мл и натрия гидрокарбонат - 24 мг/мл, позволяет обеспечить сохранность МД в плазме в течение 29 дней. 3. Методика успешно применена для изучения фармакокинетики таблетированной формы МД и показала свою пригодность для изучения биоэквивалентности. ЛИТЕРАТУРА

作者简介

A. Khokhlov

Yaroslavl State Medical University

Y. Dzhurko

Quinta-Analytica

V. Kubes

Quinta-Analytica

L. Shitov

Yaroslavl State Medical University; Quinta-Analytica

I. Yaichkov

Yaroslavl State Medical University

Email: ilya_1993_08@mail.ru

A. Shitova

Quinta-Analytica

参考

补充文件