COMPARATIVE CHARACTERISTICS OF THE EXPERIMENTAL AGGLUTININS ACTIVITY OF IMMUNE SERUM AGAINST STRAINS OF BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI AND BURKHOLDERIA MALLEI ISOLATED IN DIFFERENT REGIONS

Full Text

Agglutination, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei. Возбудители мелиоидоза (Burkholderia pseudo- Сап (возбудитель B. mallei) - зоонозная антропоmalle/) и сапа (Burkholderia mallei) относятся к микро- ургическая инфекция, регистрируемая в Монголии, Турорганизмам II группы патогенности (опасности). Ука- ции, Иране, Ираке, странах Аравийского полуострова, занные микроорганизмы являются потенциальными Китае, Индии, Индонезии, Филиппинах [14]. Случаи заагентами биотерроризма группы В [7], и не исключена ражения человека связаны с профессиональной деятельвозможность преднамеренного их использования в ка- ностью: ветеринары, работники мясоперерабатывающих честве биологического оружия [4, 8, 14]. Их роль в предприятий, сотрудники лабораторий, дрессировщики инфекционной заболеваемости человека и некоторых лошадей. B. pseudomallei (возбудитель мелиоидоза) животных рассматривается в связи с существовани- входит в состав микробиоты почвы и воды стоячих воем эндемичных регионов и появлением завозных слу- доемов. К странам, где распространен возбудитель мечаев инфекций. лиоидоза, относятся Индия, Шри-Ланка, Филиппины, 44 Выпуск 1 (65). 2018 Индонезия, Таиланд, Сингапур, Вьетнам, Малайзия, Бирма, Бразилия, Пуэрто-Рико, острова Карибского бассейна, Африка и Австралия. В США, Тихоокеанском регионе, Европейских странах были зарегистрированы спорадические случаи этого заболевания у людей, прибывших с эндемичных территорий [5]. Наибольшее число заболеваний за период 2000-2016 гг. отмечено в Таиланде и Северной Австралии. Согласно опубликованным в 2016 г результатам прогнозно-аналитических исследований специалистов Oxford, Cambridge (Великобритания), Mahidol (Таиланд), Fortaleza (Бразилия), Департамента пандемических и эпидемических заболеваний ВОЗ (Швейцария) и других исследователей, современная заболеваемость мелиоидозом в мире может быть оценена на уровне 165 000 случаев в год, а уровень смертности - около 80 000 ежегодно [10]. Отсутствие характерной симптоматологической картины, затрудняющей клиническую диагностику, высокая смертность среди больных острыми формами (пневмонией, септицемией), а также длительная, далеко не всегда эффективная антибактериальная терапия при хроническом течении инфекции являются основными причинами, требующими по отношению к мелиоидозу пристального внимания специалистов учреждений здравоохранения и санитарно-эпидемиологических служб. В практической работе для ускоренного выявления и последующей идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза используют молекулярно-генетические методы (масс-спектрометрия, ПЦР-анализ) и иммуно-диагностические тесты с использованием моноклональных антител (МКА) [9, 13]. Метод ориентировочной реакции агглютинации на стекле наиболее прост, не требует дополнительного оборудования и может быть достаточно легко выполнен. Антигенный состав штаммов В. pseudomallei и B. mallei неоднороден, зависит, как правило, от географической принадлежности штаммов и обуславливает результаты агглютинации различными сыворотками. В литературе описаны случаи, когда отдельные штаммы В. pseudomallei не были идентифицированы посредством этого метода. Так, изолят, выделенный от больного хроническим мелиоидозом в Дарвине (Австралия), не агглютинировался мелиоидозной сывороткой. Диагноз мелиоидоз был поставлен данному пациенту еще в 1989 году и в настоящее время он является единственным живым человеком с таким хроническим заболеванием, периодически рецидивирующем на протяжении 25 лет Сравнительная характеристика геномов штаммов, выделенных в начале, на протяжении всего времени болезни, и в 2014 году, выявила различия в экспрессии многих генов, участвующих в патогенезе. Особый интерес представляла утрата экспрессии гена wcbR, кодирующего синтазу жирных кислот, необходимую для синтеза капсулярного полисахарида. По мнению авторов, именно данный факт объясняет отрицательные результаты агглютинации выделенного изолята [6]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Выявление наиболее эффективной экспериментальной сыворотки для предварительной идентификации патогенных буркхольдерий в РА. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Для работы использовали штаммы возбудителей сапа и мелиоидоза: B. mallei - 9, B. pseudomallei -37 штаммов, мутантный авирулентный штамм B. pseudomallei VPA коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора. Культивирование микроорганизмов проводили на Nutrient-агаре, рН 6,8, при 37 °С в течение 48 ч. Использовали четыре вида экспериментальной кроличьей иммунной сыворотки: к живым клеткам ави-рулентного штамма B. pseudomalei VPA, к инактивированным кипячением клеткам штамма B. pseudomalei С-141, к экстрацеллюлярным антигенам (ЭЦА) B. thailandensis 264 и комплексная сыворотка к клеткам штаммов B. thailandensis251, 264, 265, 295 и 299, полученных сотрудниками лаборатории сапа и мелиоидоза [1, 2]. Реакцию агглютинации (РА) проводили объемным методом. Из сыворотки готовили двукратные последовательные разведения от 1:20 до 1:1280, в которые в равном объеме добавляли антиген (Аг) в виде бактериальной суспензии в 0,15 М NaCl pH 7,2 ± 0,2 в конечной концентрации 5 х 102 м.к./мл (кроме контроля). Пробирки встряхивали и оставляли на 2 часа при температуре (37 ± 0,1) °С, затем учитывали предварительный результат реакции. Окончательный результат реакции агглютинации регистрировали через 18-20 часов инкубации при комнатной температуре. При учете результатов реакции агглютинации степень разведения сыворотки, при которой реакцию считали положительной, расценивали как низкую (1:101:40), среднюю (1:80-1:320) и высокую (1:640-1:2560). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Поскольку стандартные (производственные) диагностические видоспецифические сыворотки ни для одного вида буркхольдерий не выпускаются, в условиях специализированных лабораторий для постановки диагностических иммунологических реакций используют экспериментальные серии препаратов. Для получения иммунных сывороток от лабораторных животных в работе чаще всего используют либо живые клетки авирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза и сапа и штаммов филогенетически родственных непатогенных видов, либо антигенные комплексы B. pseudomallei и B. mallei. Ранее сотрудниками ФКУЗ Волгоградский научноисследовательский противочумный институт Роспотребнадзора был получен авирулентный пуринзависимый штамм B. pseudomallei VPA, селекционированный из Выпуск 1 (65). 2018 45 Шєтрій ©шгГІМЩ штамма B. pseudomallei С-141 с помощью химического мутагенеза. В литературе отмечено, что с приобретением ауксотрофности по аденину (пуриновой зависимости) штаммы B. pseudomallei становились авиру-лентными для мышей линии BALB даже при интрана-зальном заражении в высоких дозах [11, 12]. В настоящей работе мы исследовали четыре вида экспериментальной кроличьей иммунной сыворотки, полученной к живым клеткам авирулентно-го штамма B. pseudomallei VPA, к инактивированным клеткам референтного штамма B. pseudomallei С-141 и к клеткам близкородственного условно патогенного вида B. thailandensis (к ЭЦА и к живым клеткам комплекса из 5 штаммов B. thailandensis 251, 264, 265,295 и 299). В результате, исследуемые коллекционные штаммы возбудителей сапа и мелиоидоза агглютинировались всеми используемыми экспериментальными сыворотками в различных разведениях (рис. 1). 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 Разведение сыворотки • к клеткам B. pseudomallei VPA ♦ к Аг B.pseudomalei С-141 " Д " к клеткам B.thailandensis 251, 264, 265,295, 299 ™Х ■ к ЭЦА B.thailandensis 264 Рис. 1. Показатели агглютинации штаммов B. pseudomallei и B. mallei экспериментальными сыворотками Наиболее активной оказалась сыворотка, полученная против живых клеток авирулентного мутанта B. pseudomallei VPA, в развернутой реакции агглютинации с живыми микробными клетками (м.к.) возбудителя мелиоидоза, менее активна была сыворотка против инактивированных клеток вирулентного референтного штамма B. pseudomallei С-141, а с сыворотками против B. thailandensis агглютинация наблюдалась только в низких разведениях. При исследовании штаммов возбудителя мелиоидоза, три штамма B. pseudomallei VPA, 57576, 60839 агглютинировались всеми использованными сыворотками в высоких разведениях (1:1280), шесть штаммов B. pseudomallei ВКМ-900, 57582, 611083, 109, 56738, 60806 - в низких разведениях (1:20-1:40) (рис. 2). Перечисленные штаммы характеризовались высоким уровнем вирулентности для золотистых хомячков (LD 50 1-10 м.к., за исключением авирулентного мутанта B. pseudomallei VPA) и были выделены во Вьетнаме (за исключением B. pseudomallei 109 - в Австралии). Вместе с тем, в более раннем аналогичном исследовании было установлено, что некоторые коллекционные штаммы возбудителя мелиоидоза австралийского происхождения отличались низкой способностью к агглютинации. Особенно выделялись два штамма -B. pseudomallei 111 и 114, у которых было выявлено отсутствие Аг6, одного из основных антигенных комплексов возбудителя мелиоидоза [3]. VPA, 57576, 60839 • к Аг B.pseudomalei С-141 ■ к клеткам B. pseudomallei VPA " к ЭЦА B.thailandensis 264 - - -к клеткам B.thailandensis 251, 264, 265,295, 299 Рис. 2. Агглютинация клеток коллекционных штаммов B. pseudomallei экспериментальными сыворотками (по радиальной шкале - значения различного титра сывороток: от 1:20 до 1:1280) В результате изучения штаммов возбудителя сапа четыре штамма B. mallei5584, B-120, 10230, Muksuwar агглютинировались всеми использованными сыворотками в средних и высоких разведениях (1:160-1:1280), три штамма B.mallei Будапешт, Z-12, 11 - в низких разведениях (1:10-1:40) (рис. 3). 10230 Рис. 3. Агглютинация клеток коллекционных штаммов B. mallei экспериментальными сыворотками (по радиальной шкале - значения различного титра сывороток: от 1:20 до 1:1280) Стоит отметить, что основная масса штаммов патогенных буркхольдерий (83 %) агглютинировалась в РА сывороткой, полученной против живых м.к. B. pseudomallei VPA в высоких разведениях, менее 46 Выпуск 1 (65). 2018 активна была сыворотка против инактивированных клеток B. pseudomallei С-141, с комплексной сывороткой против B. thailandensis и с ЭЦА B. thailandensis 264 агглютинация наблюдалась только в низких разведениях, за исключением отдельных штаммов. Сыворотки против штаммов B. pseudomallei VPA и B. pseudomallei С-141 были получены традиционным способом иммунизации животных, предусматривающего применение в качестве антигена цельные живые клетки или инактивированные взвеси м.к. с широким антигенным спектром. Подобный подход не всегда приводит к получению высокоактивных, а тем более специфичных сывороток. Судя по результатам РА, иммунизация инактивированной взвесью м.к. приводила к формированиюменее активной сыворотки, чем при иммунизации живыми м.к. Это может быть объяснено тем, что из-за процедуры предварительной инактивации клеток B. pseudomallei в организме лабораторных животных формировались антигенные комплексы со сниженной иммуногенностью. При этом взвесь для иммунизации содержала цельные убитые м.к., разрушенные и также определенный процент балластных веществ, что также не способствовало формированию высокоактивной и специфичной сыворотки. Виды B. pseudomallei и B. thailandensis являются фенотипически и генетически близкородственными, с существенной разницей только в вирулентности по отношению к человеку и животным. Потому B. thailandensis часто применяют в различного рода исследованиях как авирулентный аналог возбудителя мелиоидоза. B. pseudomallei и B. mallei имеют очень сходную антигенную структуру, и именно поэтому для предварительной идентификации возбудителя сапа возможно использование иммунной сыворотки, полученной против возбудителя мелиоидоза. Известны как видовые, так и перекрестнореагирую-щие и общие антигены B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis, что объясняет то, что штаммы патогенных буркхольдерий агглютинировались сыворотками, полученными против B. thailandensis, однако только в низких разведениях. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, штаммы возбудителей сапа и мелиоидоза коллекции ФКУЗ Волгоградский научноисследовательский противочумный институт Роспотребнадзора агглютинировались всеми используемыми экспериментальными сыворотками, но в различных разведениях. 8 % штаммов B. pseudomallei и 44 % штаммов B. mallei агглютинировались сыворотками в средних и высоких разведениях (1:160-1:1280); 16 % штаммов B. pseudomallei и 33 % штаммов B.mallei - в низких разведениях (1:10-1:40). Четкой корреляции между характером агглютинации и географической принадлежностью штаммов, а также уровнем их вирулентности выявлено не было. Наиболее эффективной экспериментальной сывороткой для предварительной идентифика ции патогенных буркхольдерий в РА оказалась сыворотка, полученная против живых м.к. авирулентного штамма B. pseudomallei VPA.

About the authors

E. V. Molchanova

FPHI «Volgograd Research Plague Control Institute» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare

Email: elenakalinki@yandex.ru

N. P Ageeva

FPHI «Volgograd Research Plague Control Institute» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare

D. M Frolov

FPHI «Volgograd Research Plague Control Institute» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare

I. Yu Mazurova

FPHI «Volgograd Research Plague Control Institute» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare

References

Supplementary files