EXPRESSION OF MATRIX METALLOPROTEINASE-9 AND TISSUE INHIBITOR OF MATRIX METALLOPROTEINASES-1 IN THE LIVER IN NEONATAL MICE OF CBA AND C57B1/6 LINES, WHICH UNDERWENT CHRONIC INTRAUTERINE HYPOXIA

全文:

Matrix metalloproteinase-9, tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-1, chronic intrauterine hypoxia, liver, newborns, mice of CBA and C57Bl/6 lines. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучить экспрессию матриксной металлопротеи-назы 9 (ММР-9) и ее тканевого ингибитора 1 (TIMP-1) в гепатоцитах и непаренхиматозных клетках печени у новорожденных мышей двух оппозитных линий СВА и С57В1/6, после перенесенной хронической внутриутробной гипоксии (ХВУГ). МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты выполнены на мышах оппозитных по ряду структурно-функциональных параметров органов и систем линий СВА и С57В1/6 и их потомстве [2, 4]. Животные-производители (массой 20-22 г) были получены из лаборатории разведения экспериментальных животных Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск). ХВУГ моделировали помещением беременных самок на 13-й день беременности в барокамеру с «подъемом» на высоту 9000 м, в течение 4 часов, ежедневно 7 дней [7]. Новорожденные мышата линий СВА и С57В1/6 были разделены на 4 группы по 10 животных в каждой: 1-я (линия СВА) и 2-я (линия С57В1/6) группы - новорожденные мышата, перенесшие ХВУГ ; 3-я (линия СВА) и 4-я (линия С57В1/6) группы - животные контрольных групп. Новорожденных мышей в течение первых суток после рождения выводили из эксперимента путем де-капитации под эфирным наркозом. Все манипуляции с лабораторными животными проводили, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Страсбург, 1986), принципы гуманности, изложенные в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС), «Принципы надлежащей лабораторной практики» (ГОСТ Р53434-2009 от 01.03. 2010 г идентичен GLPOECD). В соответствии со стандартизированными протоколами и рекомендациями фирм-производителей антител в парафиновых срезах печени проведены иммуно-гистохимические исследования с использованием моноклональных антител Rabbit MMP-9, cloneE127 («ThermoFisherScientificInc.», США), Mousea-HumanTIMP-1, clone 102D1 («ThermoFisherScientificInc.», Выпуск 3 (67). 2018 89 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ США) и системы визуализации DAKO EnVision+ System («DAKO», Дания) с диаминобензидином (DAB). Для количественной оценки экспрессии MMP-9 и ТІМР-1 в каждом наблюдении определяли процент положительно окрашенных гепатоцитов и непаренхиматозных клеток печени в 10 полях зрения с подсчетом среднего значения. Статистическую обработку данных морфометрического исследования проводили с использованием лицензированного пакета программ статистики «МіогеоА-Excel 2010» с определением средней величины (М), стандартной ошибки средней (m). Достоверность статистически значимых различий средних величин в сравниваемых группах рассчитывали по t-критерию Стью-дента при p < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Ранее показано, что воздействие ХВУГ привело к значительным деструктивным изменениям в паренхиме печени новорожденных мышат линий CBA и C57BI/6, более выраженным у мышей линии С57В1/6. Процессы репаративной регенерации паренхимы печени у мышей линии C57BI/6, перенесших ХВУГ, были меньшими, чем у мышей линии СВА, и не соответствовали масштабам деструктивных изменений в паренхиме печени [2, 3]. При иммуногистохимическом исследовании цитоплазматической экспрессии ММР-9 и ТІМР-1 в печени у новорожденных мышей линий СВА и С57В1/6, после перенесенной ХВУГ, регистрировали положительные реакции на MMP-9 и ТІМР-1 в клетках очагов гемопоэза и синусоидальных клетках (крупнозернистый продукт реакции), редко в гепатоцитах (гетерогенно в виде мелкодисперсного осадка), с различной выраженностью экспрессии (рис.). У контрольных животных иммуногисто-химическая реакция в клетках печени отсутствовала. Рис. Экспрессия MMP-9 в клетках печени новорожденных мышей линии СВА, перенесшей ХВУГ: MMP-9 окрашенный продукт визуализируется гомогенно в клетках очагов экстрамедуллярного кроветворения, синусоидальных клетках. Докраска гематоксилином. Ув. х 400 Более высокий уровень цитоплазматической экспрессии MMP-9 и ТІМР-1 был выявлен в клетках печени мышей линии СВА, перенесших ХВУГ, в сравнении с мышами линии С57В1/6, перенесших ХВУГ. Так, суммарный уровень цитоплазматической экспрессии ММР-9 в клетках гемопоэза, синусоидальных клетках и гепатоцитах у мышей линии СВА, перенесших ХВУГ, в 10,1 раз превышал аналогичный показатель у мышей линии С57В1/6. Одновременно с увеличением цитоплазматической экспрессии MMP-9 отмечено повышение экспрессии TIMP-1 в тех же клетках (табл.). Суммарный уровень цитоплазматической экспрессии TIMP-1 у мышей линии СВА, перенесших ХВУГ, был большим в 21,2 раза, чем аналогичный показатель у мышей линии С57В1/6. Выявленное одновременное повышение экспрессии TIMP-1 и MMP-9 может рассматриваться как компенсаторная реакция, направленная на подавление TIMP-1 гиперстимулированной активности MMP-9. Как результат значительной экспрессии MMP-9 и ее ингибитора у мышей линии СВА, перенесших ХВУГ, соотношение MMP-9 / ТІМР-1 составило < 1,0 (в норме соотношение MMP / ТІМР составляет 1:1 [10]). В свою очередь, низкие значения экспрессии ТІМР-1 в клетках печени у мышей линии С57В1/6, перенесших ХВУГ, привели к тому, что соотношение MMP-9 / ТІМР-1 было >1 (табл.). Экспрессия ММР-9 и TIMP-1 в клетках печени мышей линий СВА и С57В1/6, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию (M ± mj Локализация Линия мышей CBA 1 C57BI/6 MMP-9 Гепатоциты 0,78 ± 0,37 0,02 ± 0,01 Клетки очагов гемопоэза 13,44 ± 0,70* 0,68 ± 0,05* Синусоидальные клетки, включая клетки Купфера 3,08 ± 0,33* 0,62 ± 0,07* Суммарный показатель 17,32 ± 0,68* 1,71 ± 0,22* ТІМР-1 Гепатоциты 0,39 ± 0,12 0,04 ± 0,01 Клетки очагов гемопоэза 15,04 ± 0,40* 0,51 ± 0,07* Синусоидальные клетки, включая клетки Купфера 3,48 ± 0,19* 0,35 ± 0,07* Суммарный показатель 18,89 ± 0,42* 0,89 ± 0,14* MMP-9/ ТІМР-1 Гепатоциты 2,08 ± 1,31 0,49 ± 0,18 Клетки очагов гемопоэза 0,89 ± 0,02* 1,42 ± 0,15* Синусоидальные клетки, включая клетки Купфера 0,88 ± 0,06* 2,18 ± 0,43* Суммарный показатель 0,92 ± 0,02* 1,74 ± 0,20* ^Достоверные межлинейные различия средних величин соответствующих параметров, р < 0,05. Известно, что MMPs секретируются как проферменты различными клетками: нейтрофилами, моноцитами, макрофагами, фибробластами, эпителиальными и эндотелиальными клетками и активируются путем про-теолитического расщепления [6]. Вероятно, выявленная 90 Выпуск 3 (67). 2018 динамика значений MMP-9 и ТІМР-1 у новорожденных мышей разных линий с ХВУГ сопряжена с ведущей ролью лейкоцитов, являющихся одними из основных продуцентов MMP-9 [8]. Так, в клетках очагов гемопоэ-за у мышей линии СВА, перенесших ХВУГ, уровень цитоплазматической экспрессии ММР-9 в 19,8 раза превышал аналогичный показатель у мышей линии С57В1/6, уровень цитоплазматической экспрессии TIMP- 1 - в 29,5 раза. Соотношение MMP-9 / ТІМР-1 (< 1,0) в клетках очагов гемопоэза у мышей линии СВА, перенесших ХВУГ, было меньшим в 1,6 раза в сравнении с величиной аналогичного показателя у мышей линии С57В1/6 (MMP-9 / ТІМР-1 >1,0). В то время как экспрессия MMP-9 и TIMP-1 в гепатоцитах у мышей обеих линии, перенесших ХВУГ, была незначительной и значимых межлинейных различий не имела (табл.). В синусоидальных клетках, в состав которых входят клетки Купфера, являющиеся продуцентами металлопротеи-наз [9], у мышей линии СВА, перенесших ХВУГ, уровень цитоплазматической экспрессии ММР-9 в 4,97 раз превышал величину аналогичного показателя у мышей линии С57В1/6, уровень цитоплазматической экспрессии TIMP-1 - в 9,94 раза, а соотношение MMP-9 / ТІМР (< 1,0) у мышей линии СВА, перенесших ХВУГ, было меньшим в 2,48 раза аналогичного показателя у мышей линии С57В1/6 (где MMP-9 / ТІМР >1,0) (табл.). Одним из механизмов усиления экспрессии MMP-9 в клетках очагов гемопоэза и синусоидальных клетках мог стать оксидативный стресс, обусловленный хронической внутриутробной гипоксией [5]. Разная выраженность экспрессии MMP-9 и ее ингибитора ТІМР-1 обусловило различную динамику деструктивных процессов в печени у мышей оппозит-ных линий на фоне ХВУГ [2]. Выраженные деструктивные изменения в печени у мышей линии С57В1/6, вероятно, обусловлены более выраженной экспрессией ММР-9 (соотношение ММР/ ТІМР составило более 1,0) в клетках печени. Разнонаправленная динамика значений MMP-9 и ТІМР-1 у новорожденных мышей разных линий с ХВУГ может быть сопряжена с ведущей ролью лейкоцитов, являющихся одними из основных продуцентов MMP-9 и ТІМР-1, что, вероятно, у мышей линий СВА и С57В1/6, перенесших ХВУГ, имеет место разное соотношение видов и степени зрелости клеток в очагах гемопоэза и синусоидальных клеток [1]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. У новорожденных мышей линии C57BI/6, перенесших ХВУГ, выявлена слабая экспрессия ММР-9 и еще более низкий уровень экспрессии TIMP-1 в клетках очагов гемопоэза, синусоидальных клетках, что обусловило соотношение ММР-9 / TIMP более 1. 2. У новорожденных мышей линии CBA, перенесших ХВУГ, отмечена выраженная экспрессия ММР-9 и более высокий уровень экспрессии TIMP-1 в клетках очагов гемопоэза, синусоидальных клеток, что обусловило соотношение ММР-9 / TIMP менее 1. 3. Суммарный уровень экспрессии ММР-9 и TIMP-1 в клетках гепатоцитов был более выраженный у мышей линии СВА, в сравнении с мышами линии С57В1/6.

作者简介

S. Mozoleva

FSBEI HE «Novosibirsk State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

A. Nadeev

FSBEI HE «Novosibirsk State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation; SRI of Experimental and Clinical Medicine at the Federal Research Center «Fundamental and Translational Medicine»

Email: nadeevngma@mail.ru

S. Pozdnyakova

FSBEI HE «Novosibirsk State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

T. Ageeva

FSBEI HE «Novosibirsk State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

P. Elyasin

FSBEI HE «Novosibirsk State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

参考

补充文件