ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ ПРЕСНОВОДНОЙ РЫБЫ ДАНИО РЕРИО В ДОКЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

Полный текст

Доклинические исследования - это исследования болезней человека с использованием экспериментальных моделей на животных. Накоплен достаточно большой опыт использования биологических моделей крыс, мышей, собак, кроликов -все они имеют свои плюсы и минусы. Выбор биомодели определяется степенью схожести с организмом человека. Необходимо отметить, что ни одна биологическая модель не может в точности воссоздать модель болезни у человека. Основная цель доклинических исследований направлена на решение лишь некоторых задач: открыть новые свойства вещества, определить токсические свойства действующего вещества и лекарственной формы, изучить фармакологическую активность действующего вещества. Особую актуальность приобретает использование биологических моделей - менее затратных, информативных, достаточно изученных и описанных. Danio rerio (Zebrafish, зебрафиш) - сравнительно маленькая, пресноводная тропическая рыбка, имеющая продолговатую форму тела, окрас от светло-серебристого с ярко желтыми полосами, до темно серебристого цвета чешуи с желтозелеными полосами вдоль тела. Взрослая особь, обитающая в естественных условиях, имеет длину тела до 8 см, выращенная в искусственных условиях - до 5-6 см. Естественным ареалом обитания являются реки и ручьи Индии, Бангладеша, Непала. Рыбка ведет стайный образ жизни, преимущественно в верхних слоях водоема. Половозрелость наступает в 5-8 месяцев. Продолжительность жизни в неволе до 3 лет, в естественных условиях 5-6 лет. На ранних этапах развития различия между полами незначительны. С 5 месяцев самцы отличаются от самок более вытянутым телом, насыщенным окрасом, а самки имеют округленное брюшко и бледный окрас. Сезонность в размножении не выражена, оптимальными условиями для нереста можно считать параметры: летом от +21 до +25 °С, зимой от +18 до +23 °С, жесткость воды 10, рН от 6 до 7. В современных доклинических испытаниях большую популярность получает биомедицинская модель тропической рыбки Danio rerio (Zebrafish). Детально описанный эмбриогенез: важной особенностью этой биологической модели можно считать прозрачные эмбрионы, которые позволяют изучать терратогенез различных веществ [13]. Быстрые этапы развития - через 3 дня после оплодотворения начинает функционировать сердечно-сосудистая система, нервная система, а на 4-й день образуется половозрелый малек, способный к питанию и передвижению [18]. В связи с нарастающим антропогенным загрязнением водоемов Danio rerio получили широкое распространение как тест-система качества очистки водоемов. Описано токсическое воздействие графе-на на организмы. Графен - это прочный, легкий, электропроводящий материал углеродной модификации. Изучению токсического воздействия этого вещества на организм человека посвящено исследование [23]. В статье описывается морфология повреждения жабер Danio rerio при воздействии графена: гиперплазия жабер и начальные проявления некроза. В печени выявлено неравномерное распределение гепатоцитов, с периферическим расположением ядер, начальные проявления некроза. Для изучения острой токсичности используют эмбрионы, мальки, половозрелых особей Danio rerio. Так, в исследовании «Evaluation of Chronic Nanosilver Toxicity to Adult Zebrafish» Roberta Peco-raro [20] говорится о том, что при изучении острой токсичности на рыбках этого вида учитывается только концентрация вещества в воде, а точное количество поглощенного соединения не определяется, следующей особенностью использования этой биомодели в токсикологии, как приоритетной, авторы называют эмбрионы зебрафиш, поглощающие токсические соединения из воды через кожу и жабры, а после 7 суток развития поглощение происходит через рот [15]. Абсорбция, распределение, метаболизм и экскреция веществ только начинают подробно изучаться [5]. Danio rerio активно используется и в качестве биологической модели депрессии и стресса. Методика следующая: рыбок, пребывающих в одной стае, по двое перемещают в другой сосуд. Учитывается поведенческая особенность этого вида рыб: ведут стайный образ жизни, а при разделении пар или отделении от стаи проявляется тревожное и агрессивное друг к другу поведение, что формирует доминантно-подчинительные отношения. Сначала их помещают в сосуд с фармакологическим препаратом (селективным ингибитором обратного захвата серотонина), а затем переносят в отдельный аквариум, оценивают положение тела в пространстве и траекторию движения в воде, проявление агрессии друг к другу [3, 8]. Проведенное исследование показало, что рыбки могут использоваться в качестве модельного объекта для изучения депрессии, исследование менее затратно по сравнению с применением других экспериментальных животных, а сам эксперимент стресса и депрессии занял неделю. Заболевания щитовидной железы являются серьезными для всех возрастных групп, особенно для детей. Гипо-гипер-состояния щитовидной железы влекут за собой серьезные заболевания. Блаженко А.А., Качанов Д.А., Прошин С.Н. изучали влияние гипо-гипертиреоидного состояния на развитие личинок рыбок на примере применения пропил-тиоурацила (0,5%-я субстанция), L-тироксина (0,1%-я субстанция). Получили следующие данные: летальность личинок и нарушение двигательной активности и кровообращения в группе личинок, подвергшихся воздействию 0,1%-го L-тироксина, составила 50 % (из 18 личинок), в этой группе было большее тератогенное воздействие уже на 2-е сутки, в группе с 0,5%-м пропилтиоурацилом -25 % (из 18 личинок). Недостаточное, как и избыточное влияние гормонов щитовидной железы оказывает неблагоприятное влияние на состояние и развитие икринок Danio rerio, гипертиреоидное состояние сказывается больше на развитии и выживаемости икринок. Сам эксперимент занял всего неделю, что можно считать относительно коротким, но результативным исследованием, по сравнению с другими бимоделями [1]. Широкое применение биомодель зебрафиш получила для исследования и разработки лекарственных препаратов. Приоритетным можно считать изучение токсичности и канцерогенеза на данной биологической модели. В исследовании определялась летальная концентрация для 50 % популяции (LC50) 18 токсичных веществ, в том числе и некоторых лекарственных препаратов. Оказалось, что эмбрионы зебрафиш более чувствительны к токсическому действию, чем млекопитающие [19]. Важным преимуществом использования Danio rerio в токсикологии можно считать прозрачные эмбрионы и большую чувствительность к токсическим веществам. В исследовании изучали 12 токсичных соединений на предмет эмбриотоксичности и тератогенного воздействия [20]. При идентификации нетератогенных соединений совпадение наблюдалось в 75 % случаев, а для тератогенных -в 100 % случаев. При этом эмбрионы могут использоваться как для изучения общей токсичности, так и органотоксического действия. Эти результаты свидетельствуют о единых механизмах действии лекарств на различные органы у зебрафиш и млекопитающих [12]. Эмбрионы рыбок активно используются для изучения ангиогенеза и представляют интерес не только для изучения лекарственных препаратов на сосудистую стенку, но и изучения усиленного ангиогенеза для метастазирования опухоли [22]. Прозрачные эмбрионы могут использоваться для этих целей на живом организме. Сосуды эмбриона могут быть прокрашены и изучены посредством микроскопии. Увидеть сосудистую систему можно с помощью флуоресцирующих микросфер, которые не проникают внутрь сосудов, но связываются с их поверхностью [14]. Детально изученный геном: 70 % сходства Danio rerio и человека позволяет использовать в генетических исследованиях [24]. Функциональные домены белков, такие, например, как АТР-связывающие домены киназ, имеют 100%-ю идентичность с человеческими. Связывание лекарств часто происходит на функциональных доменах. Использование модели зебрафиш для исследования действия лекарств на человека в этой связи является возможным [10]. Описано токсическое действие некоторых лекарственных препаратов на зебрафиш с представлением экстраполяции результатов на млекопитающих: гентамицин в концентрации 5 мкМ, неомицин 10 мкМ, хинин 200 мкМ вызывают потерю волосковых клеток, дексаметазон в концентрации 324 мкМ - нефротоксичность и гепатотоксичность, метотрексат 454 мкМ - тератогенность, нефротоксичность, поражение желудочно-кишечного тракта [17]. При этом детально описаны механизмы и расширены знания: нитропруссид натрия в исследовании на зебрафиш показал выраженную периферическую вазодилатацию, аторвастатин - снижение синтеза холестерина, преднизолон - противовоспалительное действие [4]. Danio rerio используется как биомодель для изучения тестирования действия лекарств на локомоторную активность: клозапин (12,5-50 мкМ), флуоксетин (4,6 мкМ), мелатонин (0,01-100 мкМ) -как на человека, так и на рыбку оказывает седативный эффект [11, 16]. Протеомное исследование белкового состава клеток органа в данный момент времени позволяет определить токсический эффект на молекулярном уровне. Изучение изменений белкового состава под действием токсического вещества позволяет определить новые биомаркеры токсического стресса. В этой связи прозрачные эмбрионы зебрафиш, как биомодель в токсикологии, могут служить надежным чувствительным методом оценки токсичности. Продукты расщепления вителлогенинов, являющихся основными белками желтка, могут служить индикаторами токсического стресса у эмбрионов зебрафиш [14]. Моделирование заболеваний человека на Danio rerio основывается на знании патогенеза болезни у человека. При этом в настоящее время ни одна из моделей болезни человека не может быть совершенной [9] и может основываться на применении веще ства, провоцирующего то или иное заболевание [6]. Паркинсонизм у рыбок моделировали с применением нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин - разрушающего кластеры дофаминергических нейронов, который у зебрафиш и млекопитающих один и тот же. Сахарный диабет является одной из серьезных проблем в современной диабетологии, встречаясь как в терапевтической (сахарный диабет 2-го типа), так и педиатрической практике (сахарный диабет 1-го типа). Высокий рост распространенности в популяции и ранняя инвалидизация от саха рного диабета приводит к дальнейшему изучению патогенеза заболевания и созданию лекарственных препаратов противодиабетической группы. В регуляции метаболизма глюкозы инсулином у зебрафиш и млекопитающих есть много общего. Основные белки - участники инсулинсигнальной системы - структурно и функционально близки к таковым у млекопитающих [21]. Предполагается использовать экспрессию фосфоенолпируваткарбо-ксикиназы - фермента одного из этапов глюконео-генеза, у зебрафиш и у человека его транскрипция контролируется как глюкагоном, так и инсулином. Эти знания помогут совершенствовать антидиабетические препараты [2]. Механизмы апоптоза имеют много общего у человека и зебрафиш - идентифицировано семь каспаз, четыре гена апоптоза, десять участвующих в процессе апоптоза киназ - связанных с апоптозом. Именно индукция апоптоза является важным механизмом эффективной противоопухолевой терапии [7]. Для изучения веществ на развитие и стимуляцию ооцитов также могут использоваться эмбрионы зебрафиш. В исследовании М.Н. Скоблиной и соавт. впервые было показано, что достигшие дефинитивного размера окруженные фолликулярными оболочками ооциты Danio rerio, созревшие in vitro под влиянием прогестерона, овулируют в результате их обработки П^2а и полостной жидкостью карпа [27]. Danio rerio может использоваться как биологическая модель для изучения воздействия наркотических веществ фармакологической коррекции дозы. Запись электрокардиограммы подверженных воздействию кокаина рыбок Danio rerio показало увеличение ЧСС в колоколообразной зависимости от дозы. Максимальное увеличение - при дозировке 5 мг/л у большинства рыб в сравнении с базовой частотой. При воздействии более высоких доз у зебрафиш регистрировалась брадикардия [28]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящее время биомодель Danio rerio позволяет использовать зебрафиш в качестве недорогой альтернативы исследований вместо грызунов и других лабораторных животных. Накоплен достаточно большой объем знаний по развитию рыбки, ее геному и подходов к экспериментальному моделированию различных патологических состояний.

Об авторах

Андрей Владимирович Зуб

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: Andrey_zub@inbox.ru
кафедра гистологии, эмбриологии, цитологии; ассистент кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии

В. Л Загребин

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра гистологии, эмбриологии, цитологии

И. А Дворяшина

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра гистологии, эмбриологии, цитологии

А. В Терентьев

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра гистологии, эмбриологии, цитологии

Список литературы

Дополнительные файлы