DEVELOPMENT AND VALIDATION OF A QUANTITATIVE HPLC/MS/MS METHOD FOR THE DETERMINATION OF VANCOMYCIN IN BLOOD PLASMA

Full Text

Заражение метициллинрезистентным и коагулазо- фактором смертности среди данной группы пациентов. негативным стафилококком новорожденных приводит Данный факт определяет необходимость разработки к сепсису, что является широко распространенным стратегий безопасного и эффективного применения антибактериальных препаратов, одним из которых и наиболее часто используемых является ванкомицин [1]. Однако стандартные режимы дозирования ванко-мицина часто приводят к превышениям рекомендуемого уровня системной экспозиции из-за высокой вариабельности фармакокинетических параметров препарата, особенно у новорожденных детей. Следствием чего является повышенный риск нежелательных явлений и лекарственной нефротоксичности, что обуславливает необходимость проведения терапевтического лекарственного мониторинга (ТЛМ) [1, 2]. Однако для успешного проведения ТЛМ необходимо применение новых валидированных методик и технологий, знание новых физико-химических подходов к пробоподготовке биообразцов и наличие современного оборудования. В связи с этим актуальной задачей для исследований ТЛМ ванкомицина является разработка и валидация новых физикохимических методов анализа лекарственных препаратов [3, 4, 5]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Определение оптимальных условий количественного определения ванкомицина в плазме крови и валидация метода с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией (ВЭЖХ-МС/МС). МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Химические вещества и реагенты. Для приготовления маточных и стандартных растворов ванкомицина и норванкомицина как внутреннего стандарта использовались сухие навески соответствующих сертифицированных стандартов ванкомицина (Servier, Франция) и норванкомицина (Augsburg, Germany, purity grade >95,0 %), высокоочищенная вода, полученная с помощью системы MiLLi-O, муравьиная кислота для ВЭЖХ-МС (ScharLab, Испания), ацетонитрил (ScharLab, Испания). Оборудование. Для взвешивания сухих веществ использовали полумикроаналитические весы Ohaus Explorer EX225/AD. Разделение компонентов проводили с использованием ВЭЖХ системы Agilent 1260 с бинарным насосом и термостатируемым автосемплером. Анализируемые вещества детектировали с помощью гибридной масс-спектрометрической системы Sciex OTRAP 5500. Регистрация хромато-масс-спектров проводилась с использованием программного обеспечения Analyst 1.6. Интеграция пиков, расчет количественного содержания исследуемых соединений и статистическая обработка данных проводилась с помощью программы MuLtiOuant 2.4. Подготовка маточных и стандартных растворов. Для приготовления маточных и стандартных растворов ванкомицина и норванкомицина использовались сухие навески соответствующих сертифицированных стандартов веществ, которые впоследствии растворяли в сверхчистой воде. И путем последовательного разведения разводили в смеси ацетонитрил/вода в объемном соотношении 50/50 до достижения концентраций 10; 20; 50; 100; 200; 500 и 1000 мкг/мл. Подготовка калибровочных и образцов контроля качества. Калибровочные образцы готовились в концентрациях 1; 2; 5; 10; 20; 50 и 100 мкг/мл для ванкомицина. Пробоподготовка калибровочных и образцов контроля качества проводилась методом преципитации белков путем добавления к 200 мкл каждой из проб 600 мкл ацетонитрила, последующим центрифугированием в течение 2 минут при 15 000 об./мин и отбором 100 мкл надосадочной жидкости для анализа. Образцы контроля качества (КК) были приготовлены со следующими четырьмя уровнями концентрации: 1 мкг / мл (НПКО), 7,5 мкг / мл (низкий КК), 35 мкг / мл (средний КК) и 75 мкг / мл (высокий КК). Хроматографические и масс-спектрометрические условия. На хроматографической колонке PorosheLL 120 C18 (4,6 * 50 мм, 2,7 мкм) производили разделение компонентов. В данном исследовании подвижная фаза представляла собой смесь вода/ацетонитрил в соотношении 80/20. 0,1%-ю муравьиную кислоту в качестве модификатора добавляли как в водную, так и органическую составляющие мобильной фазы. Разделение компонентов проводили при постоянной температуре 25 °C, которая поддерживалась с помощью специального термостата. Объем вводимой пробы составил 10 мкл. Ионизация исследуемых веществ проводилась методом электроспрея в режиме положительной полярности (ESI - eLectrospray ionization). Валидация. Валидация разработанного метода проводилась в соответствии с правилами проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза; 2016. - Астана [7]. Линейность. Для валидации линейности исследовали калибровочные образцы, которые соответствовали концентрациям: 1; 2; 5; 10; 20; 50 и 100 мкг/мл для ванкомицина. Калибровочные кривые были построены путем построения отношения площадей пиков в зависимости от концентраций в плазме с использованием взвешенной модели линейной регрессии 1/х2. Нижний предел количественного определения был определен как самая низкая концентрация на калибровочной кривой, которая составила 1 мкг/мл. Экспериментально рассчитанные концентрации градуировочных стандартов должны лежать в пределах ±15 % от номинальных значений (за исключением НПКО, для которых эти значения могут находиться в пределах ±20 %). Точность и прецизионность. Внутридневная точность и прецизионность оценивались путем анализа шести повторностей при трех уровнях концентрации образцов контроля качества для образцов плазмы. Проводили анализ калибровочных образцов плазмы крови, соответствующих нижнему пределу количественного определения (1 мкг/мл), нижнему (7,5 мкг/мл), среднему (35 мкг/мл) и верхнему (75 мкг/мл) уровням концентраций. Анализ образцов проводили в рамках 3 последовательностей по 5 образцов для каждого уровня. При этом критерии приемлемости данных должны включать правильность в пределах ±15 % отклонения от номинальных значений и прецизионность в пределах 15 % относительного стандартного отклонения (RSD), за исключением НПКО, где оно не должно превышать ±20 %. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В процессе литературного поиска было отмечено несколько различных подходов к детектированию исследуемого вещества. На основании опубликованных данных в процессе разработки методики были оценены различные способы разработки методик количественного определения ванкомицина в плазме крови, включая режим детектирования исследуемых веществ и различные способы ионизации аналита [8, 9, 10]. Разработка метода количественного ВЭЖХ-МС/МС определения ванкомицина включала определения оптимальных параметров хроматографического разделения, а также последующей масс-спектрометрической детекции. В качестве метода ионизации был использован электроспрей (ESI). Детекция ионов проводилась в режиме положительной полярности. Разделение компонентов проводили на хроматографической колонке PorosheLL 120 C18. При разработке условий масс-спектрометрической детекции искомых веществ методом мониторинга множественных реакций (MRM) были определены ионы -«предшественники» и соответствующие им ионы -«продукты». Ионы-«предшественники» ванкомицина соответствовали частицам m/z 725,3. Наиболее интенсивными ионами-«продуктами», зарегистрированными при фрагментации протонированных молекул в ячейке соударений, были частицы m/z 88,1 и m/z 387,9 для ванкомицина (рис. 1). Рис. 1. Масс-спектр ванкомицина в плазме крови: по оси абсцисс - отношение массы к заряду m/z (Da), по оси ординат - интенсивность сигнала вестник ВОЛГОГРАДСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО МЕДИЦИНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА В ходе оптимизации условий хроматографического разделения был выбран изократический режим элюирования. Мобильная фаза состояла из смеси ацетонитрила/воды в соотношении 80/20. В качестве модификатора мобильной фазы была использована 0,1%-я муравьиная кислота. Скорость потока составляла составила 0,3 мл/мин. При этих условиях время удерживания ванкомицина составило 1,63 мин (рис. 2). Рис. 2. Хромато-масс-спектрограмма ванкомицина в плазме крови: по оси абсцисс - время (мин), по оси ординат - интенсивность сигнала При валидации разработанного метода были установлены основные валидационные параметры: линейность, прецизионность, правильность, чувствительность (нижний предел количественного определения). Разработанная методика подтвердила свою линейность во всем концентрационном диапазоне от 1 до 100 мкг/мл при использовании взвешенного коэффициента 1/х2, при этом г2 > 0,989. Коэффициент вариации (%), рассчитываемый при определении меж- и внутридневной правильности не превышал 15 % для основного диапазона концентраций. Нижний предел количественного определения методики определяли на основании данных линейности, прецизионности и правильности. Нижний предел количественного определения методики составил 1,00 мкг/мл. Полученные данные валидационных параметров приведены в табл. Таблица валидационных параметров количественного определения ванкомицина методом ВЭЖХ-МС/МС с использованием в качестве пробоподготовки преципитации белков Параметр Значение OCLOO (1 мг/мл) OCL (7,5 мг/мл) OCM (35 мг/мл) OCH (75 мг/мл) Прецизионность (CV %) Внутри цикла 3,03 12,2 4,40 6,0 Между циклами 17,8 13,5 8,03 7,64 Правильность (%) Внутри цикла 115,0 99,5 93,1 106,6 Между циклами 110,1 112,7 101,8 100,3 Селективность (%) 3,03 - - - Коэффициент корреляции 0,989 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В данном исследовании были установлены оптимальные условия количественного ВЭЖХ-МС/МС определения ванкомицина в плазме крови человека. Методика валидирована по всем требованиями Евразийского экономического союза и Европейского агентства по лекарственным средствам и соответствует всем требованиям, предъявляемым к биоаналитическим методикам. Подтвержденный аналитический диапазон методики составил 1-100 мкг/мл в плазме крови. Полученный аналитический диапазон позволяет применять разработанную методику для проведения аналитической части исследований фармакокинетики ванкомицина. Предложенный метод количественного ВЭЖХ-МС/МС определения ванкомицина может в дальнейшем использоваться для дальнейшего проведения терапевтического лекарственного мониторинга изучения вариабельности фармакокинетических параметров ван-комицина, что позволит сделать выводы о вкладе отдельных клинико-физиологических и демографических параметров в наблюдаемые межиндивидуальные отличия величины системной экспозиции ванкомицина у новорожденных с диагностированными септическими состояниями, тем самым став отправной точкой для разработки протоколов индивидуализации антибиотикотерапии, учитывающих клинико-лабораторные, демографические и другие параметры, которые необходимо принимать во внимание для обеспечения оптимального режима дозирования.

About the authors

V. I Petrov

Volgograd State Medical University

Email: brain@sprintnet.ru
MD, Professor, Academician of the Russian Academy of Sciences, Head of the Department of Clinical Pharmacology and Intensive Care, Volgograd State Medical University, Chief Freelance Specialist - Clinical Pharmacologist of the Ministry of Health of the Russian Federation, Honored Scientist of the Russian Federation, Honored Doctor of the Russian Federation Volgograd, Russia

I. S Anikeev

Volgograd State Medical University

Email: anikeivan@yandex.ru
Head of the Pharmacokinetics Laboratory, Research Center for Innovative Medicines with Pilot Production, Assistant of the Department of Fundamental Medicine and Biology Volgograd, Russia

T. E Zayachnikova

Volgograd State Medical University

Email: guz5deti@mail.ru
Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Professor of the Department of Pediatrics and Neonatology, Institute of Continuing Medical and Pharmaceutical Education Volgograd, Russia

A. V Strygin

Volgograd Scientific Medical Center

Email: drumsav@mail.ru
Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Deputy Director, Scientific Center for Innovative Medicines with Pilot Production Volgograd, Russia

A. M Dotsenko

Volgograd Scientific Medical Center

Email: ev8278@mail.ru
Assistant of the Department of Fundamental Medicine and Biology Volgograd, Russia

A. O Strygina

Volgograd State Medical University

Email: strygachenok@gmail.com
Assistant of the Department of Immunology and Allergology Volgograd, Russia

References

Supplementary files