Изменение уровней аутоантител к нейрорецепторам в сыворотке крови и ткани головного мозга крыс в динамике при хроническом введении бромокриптина

Полный текст

Ранее нами было установлено, что при хроническом введении агонистов дофаминовых рецепторов – антипаркинсонических средств – у экспериментальных животных в сыворотке крови обнаруживается повышенный уровень аутоантител к дофаминовым и к NMDA рецепторам [1]. При длительном введении антагонистов дофаминовых рецепторов нейролептиков также наблюдается повышение содержания аутоантител к этим же рецепторам [2]. Интересно, что были установлены корреляционные связи между уровнями аутоантител и выраженностью каталептогенного действия галоперидола, а также изменение поведения крыс в ситуации «открытого поля» [3, 4]. Эти данные позволили предположить, что аутоантитела к нейрорецепторам, с которыми взаимодействуют нейро- и психотропные препараты, вероятно, принимают участие в реализации их специфической активности [5].

Способность аутоантител, циркулирующих в крови, проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и оказывать воздействие на рецепторы мозга обсуждается. Предполагается возможность интратекального образования антител [6, 7]. Сравнительно недавно появилось несколько методически качественно выполненных работ, в которых приводятся данные, подтверждающие, что IgG способны диффундировать в ткань мозга у животных без повреждения гематоэнцефалического барьера [8]. В связи с этим представлялось интересным решить две задачи: выяснить способность аутоантител к нейрорецепторам проникать в ткани головного мозга у животных, а также изучить динамику уровней аутоантител в сыворотке крови и в тканях головного мозга в различные сроки хронического введения бромокриптина – прямого агониста дофаминовых рецепторов 2-го типа.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучить изменение уровней аутоантител к нейрорецепторам в сыворотке крови и ткани переднего мозга у крыс при хроническом введении бромокриптина.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты были выполнены на 46 белых лабораторных крысах самцах линии Wistar с массой тела 250–280 г, которые содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище.

Были сформированы 7 групп животных. Крысам контрольной группы (первая группа – 6 крыс) внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. Остальные животные получали внутрибрюшинно бромокриптин в дозе 1 мг/кг: вторая группа (5 крыс) в течение 2 недель ежедневно, третья (5), четвертая (5),пятая (5), шестая (5) и седьмая (15 крыс) группы в течение 4 недель ежедневно.

После завершения инъекций у крыс забирали кровь по следующей схеме: первая группа (контрольная) – через 3 дня после последней инъекции физиологического раствора; вторая группа – на следующие сутки после завершения введения бромокриптина в течение 2 недель; третья группа – на следующие сутки после завершения введения бромокриптина в течение 4 недель; четвертая группа – через 3 суток после последней инъекции в течение 4 недель; пятая группа – через 7 суток; шестая группа – через 14 суток, седьмая – через 4 недели после последней инъекции бромокриптина.

Кровь забирали в пробирки, отстаивали с течение 30 мин при температуре +37 ^оС, центрифугировали при 3000 об./мин в течение 10 мин. Полученные образцы сыворотки хранились в морозильной камере при температуре –40 ^оС. Животных (под общим обезболиванием препаратом «Золетил») декапитировали и извлекали головной мозг, который отмывали от крови холодным физиологическим раствором в течение 40–50 с, очищали от паутинной оболочки, обсушивали на фильтровальной бумаге и замораживали. Материал до проведения иммунологического тестирования хранился в морозильной камере при температуре –40^о С. Перед исследованием на наличие аутоантител (ААТ) передний мозг взвешивали, измельчали и гомогенизировали механически, добавляли охлажденный фосфатно-солевой буферный раствор (рН 7,4) в соотношении ткань : буфер – 1 : 3, перемешивали, осаждали центрифугированием при 3000 об./мин в течение 10 мин. Надосадочная жидкость использовалась для проведения иммуноферментного анализа (ИФА).

Количественное определение уровней аутоантител в сыворотке крови и супернатанте гомогената головного мозга проводили с помощью ИФА. Оценивали концентрацию ААТ (IgG) в сыворотке крови и мозговой ткани к дофаминовым рецепторам 1-го и 2-го типов (DR1 и DR2), а также к NR1, NR2A, NR2B субъединицам NMDA рецептора. Содержание ААТ к белку S100B оценивали в сыворотке крови. На твердой фазе полистироловых планшетов был иммобилизован антиген соответствующего рецептора или белка S100B (Cloud-Clone Corp. – США/КНР). Применялись тест-системы, разработанные ООО НПО «Иммунотэкс» (Россия). Исследование проводили на автоматическом иммуноферментном анализаторе «Лазурит» (Dynex Technologies, США) при длине волны 450 нм.

Статистический анализ полученных результатов измерений выполняли с применением прикладных программ STATISTICA (StatSoft Inc., США). Учитывая, что распределения не соответствовали нормальному, по данным критерия Шапиро – Уилка, применяли методы непараметрической статистики.

Исследование выполнялось в соответствии с положениями Женевской конвенции 1985 г. о «Между-народных принципах биомедицинских исследований с использованием животных» и Хельсинкской декларацией 2000 г. о гуманном отношении к животным, а также Приказа МЗ РФ № 199н «Об утверждении правил лабораторной практики» от 1 апреля 2016 г.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

У животных контрольной группы уровни естественных ААТ в сыворотке крови колебались в пределах 0,8–10,9 Ед/мл, а в ткани мозга – 1,0–1,8 Ед/мл. Длительное ежедневное введение бромокриптина вызывало выраженное (по сравнению с контролем) нарастание содержания ААТ к нейрорецепторам и в сыворотке крови (табл. 1), и в ткани головного мозга. При этом уровни ААТ в мозговой ткани были на порядок ниже (табл. 2), чем в сыворотке, что можно объяснить функционированием ГЭБ.

Анализ динамики ААТ в сыворотке крови показывает, что их уровень нарастал к концу инъекционной процедуры (4 недели введения) и начинал снижаться через 7 суток, и особенно через 14 суток после последней инъекции бромокриптина. Следует обратить внимание на то, что уровень ААТ к дофаминовым рецепторам начинал снижаться уже через 3 суток после последнего введения препарата. При этом содержание ААТ к NMDA рецепторам (NR1 и NR2A) в эти сроки еще продолжало нарастать. Через 4 недели после прекращения введения бромокриптина уровень ААТ в сыворотке крови был сопоставим с их содержанием у контрольных животных. Изменение содержания ААТ к белку S100B происходило аналогичным образом: было наибольшим через 4 недели иммунизации и затем постепенно снижалось.

В ткани переднего мозга крыс также обнаруживались высокие, по сравнению с контрольной группой крыс, уровни ААТ и к дофаминовым и NMDA рецепторам. Через 14 суток и через 4 недели после прекращения инъекций бромокриптина в ткани мозга уровни ААТ были сопоставимы с контролем.

 

Таблица 1

Изменение уровней аутоантител (Ед/мл) к нейрорецепторам и белку S100B в сыворотке крови у крыс [Me (Q1–3)]

ААТ к мозговым антигенам	2 недели введения	4 недели введения	Через 3 суток после последней инъекции	Через 7 суток после последней инъекции	Через 14 суток после последней инъекции
DR1	164,0 (156,1–169,3)	195,6 (194,3–232,0)	162,5 (140,1–168,8)	126,4 (107,4–161,8)	83,3 (78,6–90,0)
DR2	109,0 (86,7–115,9)	170,2 (169,0–175,2)	136,0 (125,9–149,9)	109,5 (106,0–142,5)	62,6 (56,2–73,1)
NR1	84,6 (82,4–85,5)	151,5 (148,9–180,1)	162,4 (151,7–171,4)	161,8 (134,4–162,6)	68,1 (67,3–85,3)
NR2A	110,6 (105,5–136,6)	168,1 (144,9–173,0)	172,5 (168,0–189,4)	157,0 (150,5–161,7)	86,9 (74,8–87,1)
NR2B	89,1 (80,4–92,2)	178,2 (142,2–178,5)	169,5 (161,6–173,8)	155,2 (151,4–162,4)	60,3 (59,1–70,8)
Белок S100B	69,6 (67,8–71,7)	80,8 (67,7–88,0)	56,3 (50,7–56,4)	67,0 (65,1–69,5)	63,6 (56,3–75,7)

 

Таблица 2

Изменение уровней аутоантител (Ед/мл) к нейрорецепторам в ткани головного мозга крыс [Me (Q1–3)]

ААТ к мозговым антигенам	2 недели введения	4 недели введения	Через 3 суток после последней инъекции	Через 7 суток после последней инъекции	Через 14 суток после последней инъекции
DR1	12,4 (4,6–12,4)	20,9 (15,6–23,6)	12,4 (7,4–16,7)	11,5 (11,1–11,8)	1,45 (1,37–1,66)
DR2	10,6 (5,4–11,7)	15,6 (8,7–24,9)	7,4 (4,1–8,3)	5,1 (5,0–6,4)	1,8 (1,6–1,97)
NR1	11,4 (11,2–11,6)	11,0 (10,8–17,5)	12,5 (11,9–16,0)	9,4 (4,4–9,5)	1,5 (1,4–1,52)
NR2A	14,9 (14,1–18,0)	19,4 (14,0–23,4)	19,9 (17,1–21,2)	11,7 (9,0–11,8)	1,37 (1,32–1,75)
NR2B	12,1 (10,4–12,6)	12,5 (10,4–13,7)	12,9 (10,1–13,1)	9,1 (7,0–9,9)	1,7 (1,6–1,8)

 

Корреляционный анализ (по Спирмену) обнаружил, что полного параллелизма между концентрацией ААТ в сыворотке крови и в ткани мозга не прослеживается. Уровень ААТ к NR2A был умеренно связан с содержанием в ткани мозга ААТ к NR1 (r = 0,4185; p < 0,05), NR2A (r = 0,4223; p < 0,05), NR2B (r = 0,4215; p < 0,05), и заметно с DR2 (r = 0,5261; p < 0,05). Выявлялась умеренная связь между ААТ к NR2B в сыворотке и содержанием DR2 в ткани мозга (r = 0,4538). Содержание ААТ к DR1 в сыворотке было связано умеренно с уровнем в мозге ААТ к NR1 (r = 0,4215; p < 0,05), NR2A (r = 0,4969; p < 0,05), заметно с мозговыми ААТ к NR2B (r = 0,5592; p < 0,05). Концентрация ААТ к DR2 была заметно связана с содержанием ААТ к этим же рецепторам в мозговой ткани (r = 0,5769; p < 0,05).

Интересно, что сывороточный уровень ААТ к белку S100B был умеренно связан с содержанием в ткани мозга ААТ к NR2A (r = 0,4700; p < 0,05), NR2B (r = 0,4423; p < 0,05) и к DR2 (r = 0,5030; p < 0,05). При этом корреляционных связей с уровнями ААТ к нейрорецепторам в крови не обнаруживалось.

Таким образом, выполненное исследования подтвердило ранее полученные данные о способности агонистов дофаминовых рецепторов повышать уровень ААТ (IgG) к дофаминовым (DR1 DR2) и к NMDA рецепторам [1, 2]. При этом было установлено, что содержание ААТ в сыворотке крови у иммунизированных животных остается высоким (по сравнению с контролем) через 7 и 14 суток после последней инъекции бромокриптина. Через 4 недели после завершения процедуры иммунизации содержание ААТ в сыворотке крови было таким же, как и у контрольной группы крыс. Важно, что хроническое применение бромокриптина вызывало повышение количества ААТ и ткани головного мозга животных. При этом достаточно высокое содержание ААТ сохранялось в течение 7 суток после последней инъекции препарата. Обнаруженная способность ААТ (IgG) накапливаться в ткани мозга совпадает с наблюдениями других авторов [8]. Это позволяет предположить, что ААТ к нейрорецепторам могут оказывать специфическое воздействие на функцию конкретных рецепторов. Возможно, что после отмены препаратов ААТ какое-то время тоже оказывают свое действие. Интересно, что уровни ААТ к белку S100B коррелировали с содержанием ААТ в ткани мозга, но не в сыворотке крови. Считают, что белок S100B, как и ААТ к нему, является важным маркером повреждений мозга [9, 10]. В связи с этим можно предположить, что накопление ААТ к NMDA рецепторам в ткани головного мозга запускает процесс эксайтотоксичности с последующим освобождением белка S100B и накоплением ААТ к нему в сыворотке крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Длительное введение бромокриптина крысам вызывает нарастание уровней ААТ к NMDA и дофаминовым рецепторам в сыворотке крови и в ткани головного мозга. После прекращения введения препарата содержание ААТ в сыворотке крови снижалось до нормальных значений через 4 недели, а в ткани мозга – через 14 дней после последней инъекции бромокриптина.

 

Финансирование. Исследование выполнено в рамках государственного задания АААА-А19-119010900 193-6, финансировалось Ставропольским государственным медицинским университетом.

Funding. The study was carried out within the framework of the state task АААА-А19-119010900 193-6, funded by the Stavropol State Medical University.

Об авторах

Мария Владимировна Батурина

Ставропольский государственный медицинский университет; Центр клинической фармакологии и фармакотерапии

Автор, ответственный за переписку.
Email: nimdark@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2745-403X

кандидат медицинских наук, доцент кафедры клинической фармакологии

Россия, Ставрополь; Ставрополь

Екатерина Владимировна Грудина

Центр клинической фармакологии и фармакотерапии

Email: kvgrud@rambler.ru

кандидат биологических наук, научный сотрудник

Россия, Ставрополь

Список литературы

Дополнительные файлы