Effect of retinal laser photocoagulation on the risk of choroidal neovascularization in experimental animals

全文:

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) – одна из основных причин слепоты у людей старше 50 лет, характеризующаяся ростом аномальных хориоидальных сосудов в наружном слое сетчатки, вызывая появление субретинальной жидкости, кровоизлияний и фиброза, что, в конечном итоге, приводит к потере центрального зрения [1].

Возрастная макулярная дегенерация – мультифакториальное заболевание, факторами риска которой являются возраст, курение, окислительный стресс, метаболический синдром и атеросклероз, приводящие к нарушению кровотока в хориоидальных сосудах сетчатки и повышению экспрессии гена VEGF-A. Ранние стадии ВМД связывают с атрофией сосудов и ишемией сетчатки, тогда как поздние стадии характеризуются хориоидальной неоваскуляризацией (ХНВ) сосудов сетчатки [2].

Классически выделяют две формы ВМД – атрофическая, или сухая, возникающая в 80–90 % случаев и проявляющаяся в виде апоптоза пигментного эпителия, сосудов хориоидеи и фоторецепторов, и, экссудативная, или влажная, встречающаяся в 10 % случаев, для которой характерен патологический рост аномальных хориоидальных сосудов в наружном слое сетчатки, прорастающих через мембрану Бруха и вызывающих появление субретинальной жидкости, кровоизлияний и фиброза [3].

Воспроизведение модели хориоидальной неоваскуляризации на животных позволяет проводить фундаментальные исследования с целью разработки новых методов лечения данной патологии. По данным литературы, известен метод создания модели хориоидальной неоваскуляризации у мышей при выполнении последовательной лазерной коагуляции сетчатки [4]. Авторы продемонстрировали возможность создания модели хориоидальной неоваскуляризации с помощью лазера Iridex (США) с длиной волны 532 нм у мышей за счет последовательного повреждения пигментного эпителия сетчатки.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Анализ результатов влияния энергии лазерного воздействия на риск возникновения хориоидальной неоваскуляризации у мышей.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования были проведены на 5 пигментированных половозрелых мышах линии C57Black/C и 5 половозрелых нелинейных мышах-альбиносах весом 20–25 г (ООО «НПК БиоТех», г. Москва), прошедших 2-недельный карантин в виварии НЦИЛС ФГБОУ ВО ВолгГМУ.

Все манипуляции с лабораторными животными и условия их содержания сопровождались соблюдением всех требований лабораторной практики при проведении доклинических исследований в Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики»). Все экспериментальные исследования проводились в соответствии со статьей 11 Федерального закона от 12 апреля 2010 г. № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» и согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Минздрава России от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики»). Процедуры с участием лабораторных животных осуществлялись с учетом этических норм обращения с животными, принятыми в Директиве Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. «О защите животных, использующихся для научных целей». Экспериментальное исследование одобрено этическим комитетом (справка № 2022/043 от 02.12.2022 года).

Непосредственно перед экспериментом животные наркотизировались путем внутрибрюшинного введения хлоралгидрата в дозе 400 мг/кг. Медикаментозный мидриаз достигался инстилляцией 15 мкл мидримакса (Sentiss Pharma Pvt. Ltd.) на конъюнктиву глаза.

На фоне седации при сохранении температуры тела животного на уровне осветителя ассистентом удерживалась мышь в положении на боку. Предметное стекло с каплей карбомера помещали на роговицу правого глаза и фокусировали световой поток щелевой лампы с лазерной апертурой на пигментный эпителий сетчатки вокруг диска зрительного нерва. Лазерные коагуляты на сетчатке формировали с помощью лазерной установки Iridex OcuLight GL (США). В отличие от человеческого глаза у глаза мыши нет четко выраженной макулы, поэтому лазерное воздействие выполнялось вокруг диска на расстоянии 1 ДД от его края, с получением микровзрыва мембраны Бруха и парагазового пузырька.

Применяли следующие параметры лазерного воздействия: мощность лазерного импульса в диапазоне от 70 до 200 мВт, экспозиция от 0,05 до 0,1 мс и диаметр пятна в диапазоне от 50 до 150 мкм, количество импульсов – от 1 до 4. Дозу лазерного излучения (А) определяли по формуле:

$А= Р \times \raisebox{1ex}{$T$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$C$}\right.$,

где Р – энергия излучения (Вт), Т – время экспозиции (с), С – площадь светового пятна луча лазера (см²) = ПD²/4.

На 14-й день эксперимента лабораторные животные подвергались эвтаназии под наркозом (400 мг/кг хлоралгидрата внутрибрюшинно), глазные яблоки были энуклеированы, для фиксации был использован свежеприготовленный модифицированный раствор Давидсона [5].

Далее материал подвергался обезвоживанию в спиртах восходящей крепости и заключался в парафиновую среду Histomix. С помощью микротома были получены срезы толщиной 4–6 мкм, которые далее фиксировали на предметном стекле. Срезы окрашивали гематоксилином и эозин-флоксином по стандартной методике [6]. Изучение и фотофиксация микропрепаратов производилась на микроскопе AxioScope A1, оборудованном цифровой камерой AxioCam MRc5.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При первичной офтальмоскопии до начала манипуляций диск зрительного нерва у мышей был бледно-розовым, границы четкие. Сосуды ДЗН дихотомически делились с равным калибром на 2, 4, 8 и 10 часах. Сетчатка была серовато-розового цвета без анатомических ориентиров макулы и отсутствием фовеолярного рефлекса. С помощью лазерного воздействия наносились ожоги на сетчатку по вышеописанной технологии с получением коагулята от серого до интенсивно белого цвета. Через неделю при осмотре визуализировался атрофический с пигментом очажок без офтальмоскопических признаков хориоидальной неоваскуляризации.

Через 2 недели при офтальмоскопии определялись коагуляты I–IV степени по классификации L’Esperance F. Хориоидальная неоваскуляризация (ХНВ) не выявлена ни в одном из случаев.

В табл. представлены значения лазерного воздействия при выполнении коагуляции сетчатки и обнаруженные визуальные изменения в сетчатке во время процедуры и через 2 недели после ее завершения.

По данным патоморфологического исследования сетчатки пигментированных мышей и мышей-альбиносов выявлены признаки отека в слое нервных волокон, перицеллюлярный отек в ганглионарном слое от выраженной степени до умеренно выраженной.

 

Доза лазерного воздействия и визуальные изменения в сетчатке у мышей во время и через 2 недели после вмешательства

Номер мыши	Параметры лазерного воздействия	Доза лазерного излучения, Вт/см2	Изменения в сетчатки после ЛК	Степень лазерного коагулята через 2 недели
1–3	Мощность 70 мВт, экспозиция 0,05 мс, диаметр пятна 100 мкм	0,045	Белое пятно без перифокального отека	1
4	Энергия лазерного импульса 90 мВт, экспозиция 0,08 мс, диаметр пятна 100 мкм	0,092	Бело-серое пятно без перифокального отека	2
5	Мощность 100 мВт, экспозиция 0,08 мс, диаметр пятна 100 мкм	0,102	Бело-серое пятно без перифокального отека	2
6–9	Мощность 150 мВт, экспозиция 0,1мс, диаметр пятна 100 мкм	0,19	Белое пятно с перифокальным отеком	2
10	Энергия лазерного импульса 90 мВт, экспозиция 0,08 мс, диаметр пятна 50 мкм	0,37	Белое ватообразное пятно с перифокальным отеком	4

 

Обнаружены выраженные дистрофические изменения в нейронах ганглионарного слоя в виде набухания перикарионов и появления сморщенных нейронов с пикнотичными ядрами. Кроме того, явления умеренно выраженного перицеллюлярного отека были выявлены во внутреннем ядерном слое, в отдельных случаях – в наружном ядерном слое. В единичных случаях выявлялись аневризматически расширенные капилляры. Во внутреннем ядерном слое были обнаружены дистрофические изменения в перикарионах нейронов.

Во всех случаях были выявлены признаки выраженного или умеренно выраженного отека в слое палочек и колбочек (рис.).

 

Рис. Гистологическое строение сетчатки глаза мыши на 14-й день после лазерной процедуры. Окраска гематоксилин-эозином. Общее увеличение ×400

 

Таким образом, через 2 недели при офтальмоскопии определялись коагуляты I–IV степени по классификации L’Esperance F. Хориоидальная неоваскуляризация (ХНВ) не выявлена ни в одном из случаев.

Вероятно, для достижения результата модели лазер-индуцированной хориоидальной неоваскуляризации необходимо последовательно, более длительно, поэтапно оказывать лазерное воздействие с повреждением пигментного эпителия сетчатки до возникновения хориоидальной неоваскуляризации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Повреждение у мышей пигментного эпителия сетчатки лазерным излучением с длиной волны 532 нм и дозами от 0,05 до 0,37 Вт/см² характеризовалось появлением коагулятов I–IV степеней по классификации L’Espe-rance F без признаков хориоидальной неоваскуляризации.

Гистологически у подопытных животных развивались выраженные дистрофические изменения в нейронах ганглионарного слоя сетчатки, что сопровождалось явлениями отека, наиболее выраженным в слое нервных волокон, ганглионарном слое и в слое палочек и колбочек без признаков роста хориоидельной неоваскуляризации.

 

***

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

作者简介

Sergey Ivanov

Eye Microsurgery named after Academician S.N. Fedorov

编辑信件的主要联系方式.
Email: mntk@isee.ru
ORCID iD: 0000-0002-6303-9493

Candidate of Medical Sciences, Director

俄罗斯联邦, Volgograd

Yulia Khzardzhan

Eye Microsurgery named after Academician S.N. Fedorov

Email: mntk@isee.ru
ORCID iD: 0000-0002-2996-5960

Candidate of Medical Sciences, Head of the Ophthalmological Department

俄罗斯联邦, Volgograd

Alexey Smirnov

Volgograd State Medical University

Email: milanaumenko@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5351-6105

MD, Head of the Department of Pathological Anatomy

俄罗斯联邦, Volgograd

Lyudmila Naumenko

Volgograd State Medical University

Email: milanaumenko@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2119-4233

MD, Professor, Department of Pharmacology and Bioinformatics

俄罗斯联邦, Volgograd

Alena Taran

Volgograd State Medical University

Email: milanaumenko@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8477-254X

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor of the Department of Pharmacology and Bioinformatics

俄罗斯联邦, Volgograd

Alina Chebanko

Volgograd State Medical University

Email: milanaumenko@mail.ru
ORCID iD: 0009-0004-3140-5040

Assistant Professor at the Department of Pharmacology and Bioinformatics

俄罗斯联邦, Volgograd

Maria Balalina

Eye Microsurgery named after Academician S.N. Fedorov

Email: mntk@isee.ru

Ophthalmologist at the Ophthalmological Department

俄罗斯联邦, Volgograd

Victoria Chubarikova

Eye Microsurgery named after Academician S.N. Fedorov

Email: mntk@isee.ru

Ophthalmologist at the Ophthalmological Department

俄罗斯联邦, Volgograd

Maxim Korotkov

Eye Microsurgery named after Academician S.N. Fedorov

Email: mntk@isee.ru

Ophthalmologist at the Ophthalmological Department

俄罗斯联邦, Volgograd

Irina Solovyova

Eye Microsurgery named after Academician S.N. Fedorov

Email: mntk@isee.ru

Ophthalmologist at the Ophthalmological Department

俄罗斯联邦, Volgograd

参考

补充文件