Increasing the accuracy of the quantitative analysis biotechnological media for the content of labile components by using thin layer chromatography

Abstract

This article present a system for quantitative analysis of the culture medium for the content of unstable or unstable components. Described a model of the process and developed software and hardware, some recommendations to further reduce the error analysis.

Full Text

Для текущего контроля биотехнологического производства необходимо помимо контроля технологических параметров (температура, давление, концентрация растворённого кислорода, величина показателя pH) анализировать содержание в культуральной среде собственно продуктов биосинтеза (например антибиотиков или аминокислот). Ввиду широкой номенклатуры получаемых методом биосинтеза продуктов в настоящее время представляется нереальным изготовление специализированных датчиков на каждый из продуктов. Сложный состав среды, часто - повышенное давление, требования к стерилизуемости датчиков вынуждают использовать отборы среды с её последующим химическим анализом. В качестве быстрого метода качественного анализа часто применяется метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), который позволяет быстро обнаруживать малые количества веществ (0,1-0,005 мкг). Суть метода состоит в том, что на хроматографическую пластинку наносят пробы разбавленной культуральной жидкости и индивидуальных веществ, край пластинки погружают в растворитель, который под действием капиллярных сил движется вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты проб, что приводит к их пространственному разделению. После хроматографирования пластинку сушат и опрыскивают соответствующим проявителем, в результате чего компоненты смеси проявляются в виде окрашенных пятен, по положению, окраске и размеру которых можно судить о качественном и количественном составе пробы. Помимо проб с неизвестным составом на пластинку наносят пробы с известной концентрацией анализируемого вещества - так называемые свидетели. Рисунок 1. Схема изображения проявленной хроматографической пластины На рисунке 1 приведена схема проявленной хроматографической пластинки: C1, C2, C3 - области, соответствующие стандартам; Пр - области, соответствующие примесям; П1, П2 - области, соответствующие пробам; А - область, соответствующая анализируемому веществу. Для количественного анализа пробы нами была разработана модель окрашенности пикселя хроматограммы. Основные допущение при построении модели: 1. Определяемое вещество полностью реагирует с окрашивающим реагентом. 2. Слой определяемого вещества достаточно тонок, но окрашенные частицы нижележащих слоёв полностью закрываются вышележащими. 3. Окрашивающий реагент равномерно (с равной вероятностью по каждому субпикселю) распределяется по всему пикселю. 4. Окраска пикселов пятна монотонно зависит количества содержащегося в соответстующей области поверхности пластины окрашивающего компонента и эта зависимость в координатах «количество вещества - интенсивность окраски» выпукла вверх, т.е. должна удовлетворять удовлетворяющая условиям: конечное значение производной при N=0 и . Здесь: - интенсивность окраски, - количество вещества в зоне хроматографической пластины, соответствующей пикселу отсканированного изображения, - параметр модели, максимальная интенсивность окраски чистого вещества. Были сформулированы условия физической реализуемости, подобраны удовлетворяющие им функции и разработаны методы их параметрической идентификации по результатам обработки фрагментов изображения пятен-свидетелей, разработано программное обеспечение, позволяющая анализировать отсканированные изображения проявленных пластин. Обычно метод ТСХ применяется для количественного или полуколичественного анализа, но применение математической обработки отсканированной хроматограммы позволило достигнуть точности определения 5-7% для ряда веществ: эритромицин А (антибиотик), L-лизин (аминокислота), мальтоза (дисахарид) [1]. Нами была предпринята попытка применить эту методику для анализа культуральной среды на содержание астаксантина (каротиноид). Поскольку астаксантин в ходе биосинтеза накапливается внутри клеток продуцента (дрожжей Phaffia rhodozyma) клетки предварительно разрушали баллистическим способом с использованием стеклянных шариков диаметром 0,2-0,5 мм и осуществляли экстракцию с помощью этилового спирта. В качестве сорбента использовался силикагель, нанесенный на стеклянные пластинки тонким слоем. Детектирование пятен при этом проводилось без использования реагентов по естественной окраске самого астаксантина (ярко оранжево-красный). Для приготовления стандартных растворов используется образец - спиртовой раствор астаксантина с заведомо известной концентрацией (определенной методом ВЭЖХ). На рисунке 2 приведено изображение отсканированной хроматограммы образцов культуральной жидкости на содержание астаксантина. Однако, оказалось что астаксантин имеет ряд существенный особенностей, препятствующих его анализу: 1. Концентрация астаксантина в экстракте мала и, соответственно, пятно на хроматограмме получается бледным. 2. При контакте с кислородом воздуха астаксантин быстро окисляется, обесцвечиваясь. Проведённая серия экспериментов показала, что даже яркое пятно (полученное с помощью спиртового раствора астаксантина значительно большей концентрации, чем ожидается в реальном процессе) за 10 минут обесцвечивается настолько, что при сканировании с глубиной цвета 24 бит/пиксел практически не обнаруживается. Дополнительные трудности связаны с неодновременным нанесением проб на пластинку и, соответственно, разным временем контакта с воздухом. Для решения этих проблем предложено наносить на одно и тоже место на пластинке не по одной, а по несколько капель последовательном в порядке прямо и обратно, т.е. некоторое конкретное пятно будет сформировано из капли нанесённой на него при прямом и капли при обратном ходе. Например, самое левое пятно будет состоять из самой старой и самой свежей капли. Рисунок 2. Пример отсканированной хроматограммы астаксантина Для корректного учёта процесса обесцвечивания проявленной хроматограммы была построена математическая модель процесса обесцвечивания: хроматограмму сканировали (с отключенными инструментами улучшения качества изображения) с периодом в 30 секунд до полного обесцвечивания пятен хроматограммы, после чего строили зависимости изменения интенсивности окраски фиксированных пикселей от времени. Полученные зависимости аппроксимировали с помощью экспоненциального закона по методу наименьших квадратов: , где - текущая интенсивность окраски в момент времени ; - интенсивность окраски в начальный момент времени (при первом сканировании); - параметр модели. Полученная зависимость позволяет провести коррекцию интенсивности окраски пикселов и снизить погрешность, возникающую из-за того, что пикселы сканируются не одновременно, а построчно, с заметной задержкой, к результате которой пикселы, расположенные ближе к нижнему краю хроматограммы - успевают обесцветиться. Проведённые опыты на образцах с известной концентрацией (определенной методом ВЭЖХ) показали снижение погрешности анализа. Таким образом, за счет применения математической обработки можно существенно повысить точность анализа с помощью метода тонкослойной хроматографии, снизить влияние человеческого фактора, упростить сравнение результатов экспериментов.