The detection of nutritional requirements of Fusarium sambucinum for the biosynthesis of protein in submerged culture

Full Text

Одними из наиболее востребованных объектов современной пищевой биотехнологии являются грибные штаммы продуценты. Сочетание технологических преимуществ, широкого спектра синтезируемых метаболитов, а также отсутствия токсичности делает возможным получение целого ряда различных биотехнологических продуктов на их основе. Одним из таких продуктов является микопротеин (пищевая биомасса мицелиальных грибов, полученная методом жидкофазного глубинного культивирования) на основе Fusarium sambucinum шт. D-104. Высокая пищевая ценность микопротеина и ряд фармакологических свойств позволяют отнести этот продукт к разряду продуктов здорового питания. Основным сдерживающим фактором в разработе промышленной технологии получения микопротеина на основе Fusarium sambucinum шт. D-104 является отсутствие научных основ направленного биосинтеза высокобелковой биомассы сложным эукариотическим организмом. Принципиальное значение для синтеза белковых веществ и накопления биомассы штаммом-продуцентом имеет характер источников углеродного и азотного питания. В связи с этим целью данной работы являлось изучение влияния различных источников углерода и азота на синтез белковых веществ и накопление биомассы F. sambucinum шт. D-104 в условиях жидкофазного глубинного культивирования. Материалы и методы В работе использовали штамм Fusarium sambucinum Fuck.var. ossicolum (Berk. et Curt.) Bilai шт. D-104, депонированный в коллекции ВКПМ под номером F-1161 (заявка на патент РФ № 2012138568) [1]. При расчете состава сред в экспериментах по изучению утилизации различных источников углерода и азота использовали эквивалентные по углероду количества сахаров и эквивалентные по азоту количества азотистых соединений в соотношении C : N = 8 : 1 [2]. Влияние источника углерода на рост и накопление биомассы и белковых веществ в глубинных условиях изучали в конических колбах V=250 мл с объемом среды 100 мл следующего состава (г/л): NH4NO3 - 3,0; KH2PO4 - 1,2; MgSO4∙7H2O - 0,2; ZnSO4∙7H2O - 0,01; тиамин - 100γ; рН = 5,6 - 5,8. В качестве источников углерода в экспериментах сравнивали глюкозу, мальтозу, фруктозу, сахарозу, ксилозу, галактозу, раффинозу, лактозу. Влияние источников углерода на рост штамма-продуцента оценивали на 40ч эксперимента, что соответствовало началу стационарной фазы роста культуры. Влияние источника азота на рост и накопление биомассы и белковых веществ в глубинных условиях изучали в конических колбах V=250 мл с объемом среды 100 мл следующего состава (г/л): глюкоза - 20,0; KH2PO4 - 1,2; MgSO4∙7H2O - 0,2; ZnSO4∙7H2O - 0,01; тиамин - 100γ; рН = 5,6 - 5,8. В качестве источников азота в эксперименте сравнивали KNO3, NH4NO3, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, NH4Сl, кукурузный экстракт. При расчете количества источников азота учитывали как нитратную, так и аммонийную формы. Количество посевного материала составляло 10 % по объему. Культивирование проводили при температуре 28 °С на круговой качалке (170 об/мин). Влияние основного углеродного субстрата на рост штамма-продуцента в глубинных условиях изучали в конических колбах V=250 мл с объемом среды 100 мл. Для крахмалсодержащих субстратов состав среды (г/л): углеродный субстрат - 20,0; KH2PO4 - 1,2; NH4NO3 - 3,0; кукурузный экстракт - 10; рН = 5,6 - 5,8. Для среды с мелассой (г/л): меласса свекловичная - 50 (2% по РВ); KH2PO4 - 1,2; NH4NO3 - 3,0; рН = 5,6 - 5,8. Количество посевного материала составляло 10 % по объему. Культивирование проводили при температуре 28°С на круговой качалке (170 об/мин). Накопление биомассы определяли весовым способом в пересчете на абсолютно сухую массу (АСМ). Последнюю определяли после высушивания образцов в стеклянных бюксах до постоянного веса при 105 оС. Массовую долю сырого протеина в биомассе определяли по методу Къельдаля по ГОСТ 28178-89. Рисунок 1. Влияние источника углерода на рост и накопление белковых веществ Fusarium sambucinum шт. D-104 Влияние источника углерода Мицелиальные грибные штаммы-продуценты способны утилизировать различные источники углеродного питания [2], в том числе и олиго- и полисахариды. Опыт по изучению зависимости накопления биомассы и белковых веществ штаммом был проведен с использованием широкого спектра источников углерода, моделирующих основные виды сырья. Согласно полученным данным (см. рисунок 1), наиболее интенсивно рост штамма-продуцента происходит на среде с глюкозой, фруктозой, ксилозой, сахарозой. Менее перспективными в этом отношении являются раффиноза, мальтоза, галактоза, лактоза. Характер синтеза белковых веществ штаммом несколько отличался от накопления биомассы. Наибольшее содержание сырого протеина было отмечено на среде с глюкозой (52,1% на АСМ), сахарозой (49,9% на АСМ), ксилозой (48,9% на АСМ) и мальтозой (51,9% на АСМ). Содержание сырого протеина на среде с фруктозой, обеспечившей высокое накопление биомассы, напротив, составило 48,3% на АСМ. Таблица 1. Влияние источника углерода на рост и накопление белковых веществ Fusarium sambucinum шт. D-104 Углеродный субстрат Накопление биомассы, г∙л-1 АСМ Содержание сырого протеина, % на АСМ Глюкоза 9,7 ± 0,24 52,1 ± 1,3 Фруктоза 9,7 ± 0,24 46,2 ± 1,1 Мальтоза 9,1 ± 0,23 51,9 ± 1,3 Сахароза 9,5 ± 0,24 49,9 ± 1,2 Ксилоза 9,6 ± 0,24 48,9 ± 1,2 Лактоза 1,8 ± 0,05 29,9 ± 0,7 Галактоза 8,4 ± 0,21 44,9 ± 1,1 Раффиноза 9,2 ± 0,23 46,9 ± 1,1 Контроль 0,6 ± 0,01 28,0 ± 0,7 Таким образом, для обеспечения накопления высокобелковой биомассы штаммом-продуцентом предпочтительно использовать среды, содержащие в качестве основного углевода глюкозу и/или мальтозу. Использование сырья с сахарозой в качестве основного источника углерода возможно, но не позволяет в максимальной степени реализовать возможности штамма. Очевидно, что меласса, содержащая сахарозу, долна быть замена. Из промышленного сырья, содержащего глюкозу и мальтозу, можно рекомендовать как наиболее доступное и дешевое крахмалосодержащее сырье, в том числе различные виды крахмалов и муки. Выбор основного сырья С целью замены неперспективного для производства пищевого продукта сырья - мелассы, рекомендованной по старой технологии, провели изучение влияния различных крахмалсодержащих субстратов на рост штамма-продуцента. Эффективность субстратов оценивали по накоплению биомассы на 24 ч эксперимента. Согласно полученным данным, штамм-продуцент активно утилизирует все изученные виды крахмалсодержащего сырья, при этом наиболее перспективными для данного продуцента являются мука кукурузная, мука тритикале и крахмал пшеничный. Экспериментально установлено, что продуктивность штамма на крахмалсодержащем сырье (9,5 - 10 г∙л-1∙сут-1) превышает данный показатель на среде с мелассой (8г∙л-1∙сут-1). Рисунок 2. Влияние различных углеродных субстратов на рост Fusarium sambucinum шт. D-104 в глубинной культуре Влияние источника азота Считается, что значительная часть грибных штаммов-продуцентов не способна утилизировать нитратный азот [3]. Предварительным этапом нашего исследования являлось установление возможности штамма-продуцента использовать нитратный азот в качестве единственного источника азота. С целью исключения влияния других форм азота на рост штамма-продуцента в глубинной культуре посевной материал для проведения эксперимента получали путем трехкратного пересева культуры на синтетическую агаризованную питательную среду, содержащую в качестве единственного источника азота KNO3, с дальнейшим пересевом на жидкую питательную среду, содержащую также в качестве единственного источника азота KNO3. Рисунок 3. Влияние источника азота на рост Fusarium sambucinum шт. D-104 В результате проведения эксперимента было установлено, что культура активно усваивает как аммонийную, так и нитратную формы азота (см. рисунок 3). Для ряда штаммов мицелиальных грибов для накопления биомассы наиболее предпочтительными являются органические источники азота [4, 5, 6]. В случае Fusarium sambucinum шт. D-104 нами показано, что для накопления биомассы органические формы азота не являются более предпочтительными. Наиболее эффективно рост культуры происходит на средах с NH4NO3, KNO3 и кукурузным экстрактом. Отмечено также, что использование в качестве единственного источника азота всех аммонийных солей, за исключением NH4NO3, приводит к закислению питательной среды (до значения рН 2,2-3,0) в процессе их утилизации и препятствует росту штамма. Поскольку синтетическая среда не обладает собственной буферной емкостью, применение данных минеральных солей в качестве источников азота возможно только в условиях рН-статирования. Следующая серия экспериментов была проведена в режиме рН-статирования 4,0. Результаты представлены на рисунке 4. Рисунок 4. Влияние источника азота на рост Fusarium sambucinum шт. D-104 в режиме рН-статирования 4,0 Согласно полученным данным (см. рисунок 4), наличие режима рН-статирования, исключающее возможность закисления ферментационной среды, во всех изученных вариантах способствует активному росту культуры. Наиболее активно рост культуры происходит на средах с NH4NO3 (12,9 г.л-1 АСМ) и (NH4)2SO4 (13,0 г.л-1 АСМ). Таким образом, в результате экспериментальных исследований установлено, что для синтеза белковых веществ Fusarium sambucinum шт. D-104 в условиях жидкофазного глубинного культивирования наиболее предпочтительными в качестве источников углерода являются глюкоза и мальтоза, в качестве источников азота - NH4NO3, (NH4)2SO4.

About the authors

E. O Nemanova

Moscow State University of Mechanical Engineering (MAMI)

8(499)267-12-06

T. V Rusinova

Moscow State University of Mechanical Engineering (MAMI)

Ph.D.; 8(499)267-12-06

E. S Gorshina

Moscow State University of Mechanical Engineering (MAMI)

Ph.D.; 8(499)267-12-06

V. V Biryukov

Moscow State University of Mechanical Engineering (MAMI)

Dr. Sc. Prof.; 8(499)267-12-06

References

Supplementary files