Introduction to the cell culture and production of brachycome iberidifolia and chrysanthemum carinatum

Abstract

Brachycome iberidifolia and chrysanthemum carinatum as cell cultures. The optimal medium for callus formation, regeneration and rooting of regenerated plants are found.

Full Text

Хризантема килеватая и брахикома иберисолистная широко используются в озеленении города, на клумбах, в миксбордерах, в срезке, обладают удивительной многоликостью красок и продолжительным цветением. Хризантема килеватая (Chrysanthemum carinatum L.) – однолетнее, обильноцветущее, с конца июня по сентябрь, растение, семейство Сложноцветных (Астровые). Соцветия – корзинки, чаще простые, реже полумахровые или махровые, душистые, довольно крупные, 5-7 см в диаметре, различной окраски. Плод – треугольная или сплюснутая семянка с крыловидными выростами. Семена сохраняют всхожесть 2-3 года. Хризантему килеватую часто выращивают на срезку, поскольку ее привлекательные соцветия могут довольно долго стоять в вазе с водой не увядая. Кроме этого она может быть с успехом использована для украшения клумб и рабаток как в одиночных посадках, так и небольшими компактными группами[1]. Брахикома иберисолистная (Brachycome iberidifolia L.) – однолетнее сильноветвистое растение, семейство Сложноцветных, высотой 15-25 см с изящными листьями, расположенными в очередном порядке. Кустики несут многочисленные мелкие соцветия – корзинки 3–3,5 см в диаметре. Применяется для оформления клумб, бордюров, альпийский горок, как горшочная культура, входит в состав мавританского газона, используемого в городском озеленении и на садовых участках [1-2]. Брахикома заслуживает самого широкого использования из-за высокой декоративности и продолжительного цветения. Обладая высокой декоративностью и неприхотливостью в уходе, эти растения чувствительны к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, что существенно ограничивает использование их в условиях высокого уровня загрязнения. Для того чтобы повысить толерантность этих растений, можно использовать клеточную селекцию, обязательным условием использования которой является введение в культуру клеток растений [3]. Цель работы: введение в культуру клеток и регенерация растений брахикомы иберисолистной и хризантемы килеватой Материалы и методы В работе использованы семена брахикомы иберисолистной (Brachycome iberidifolia L.) сорт Голубая Неженка и хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatum L.) сорт Эльдорадо. В качестве эксплантов использовали семена растений. Экспланты стерилизовали однократной обработкой спиртом с последующей стерилизацией раствором, содержащим гипохлорит натрия в течение 15-30 минут (в зависимости от растения). Затем их три раза промывали стерильной дистиллированной водой. Оптимальное время стерилизации определяли по жизнеспособности первичных эксплантов и зараженности фитопатогенами. Для культивирования in vitro применяли агаризованные питательные среды Мурасиге-Скуга (МС) [4] и Гамборга (В5) [5] в сочетании с 3% сахарозы. В качестве регуляторов роста в питательные среды добавляли 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), 6-бензиламинопурин (БАП) и α-нафтилуксусную кислоту (НУК), индолилуксусную кислоту (ИУК), кинетин в различных концентрациях и комбинациях Результаты и обсуждения Работ по введению культуру клеток брахикомы нет, нами были использованы питательные среды Мурасиге-Скуга и Гамборга. По результатам работы установлено, что каллусы образовывались во всех вариантах опыта, при концентрациях 2,4-Д от 1 до 10 мг/л на средах МС и В5, но на концентрациях 1, 2, 4 мг/л 2,4-Д наблюдалось интенсивное прорастание семян. Процент образования каллусов на среде В5 был больше, чем на среде МС, например на среде МС при концентрации 2 мг/л частота каллусообразования составляла 15,6 %, а на среде В5 – 25,4%. При концентрации 1 мг/л 2,4-Д на питательной среде В5 – интенсивность каллусообразования составляла 11,3%, при концентрации 4 мг/л 2,4-Д – 34,7%, а на среде МС 9,6% и 24,4% соответственно (таблица 1). Каллус образовывался светло-желтого цвета, средней плотности, в течение 10-14 дней. Добавление в среду 2 мг/л кинетина, в сочетании с различными концентрациями 2,4-Д, увеличивало процент образования каллусов. При добавлении кинетина в среду с 4 мг/л 2,4-Д каллусобразование увеличивалось с 34,7% до 42,1%; при концентрации 8 мг/л 2,4-Д – с 43,3% до 48,1%. Оптимальной средой для каллусообразования брахикомы иберисолистной была среда В5 с 6 мг/л 2,4-Д и 2 мг/л кинетина (56,1%). Таблица 1 Влияние 2,4-Д и Кинетина в питательной среде на интенсивность каллусообразования брахикомы иберисолистной (X±х). Для дальнейшего культивирования и регенерации полученные каллусы брахикомы иберисолистной пересаживали на питательную среду МС с половинным содержанием всех минеральных компонентов (½ МС). Для стимулирования процесса образования регенерантов в питательную среду добавляли фитогормоны БАП и НУК в различных концентрациях и комбинациях. Наибольший процент образования регенерантов был на среде ½ МС с 0,1 мг/л НУК и 2 мг/л БАП (62,3%). Регенеранты образовывались через 2-3 пассажа, темно-зеленого цвета. Хризантема оказалась трудоемкой культурой, было рассмотрено большое количество комбинаций питательных сред и фитогормонов для каллусообразования и регенерации растений. К тому же большинство работ по культуре клеток хризантемы связано с микроклональным размножением хризантемы многолетней, другого вида хризантем (дендрантема) [6-7], так как большинство традиционно относимых к роду Chrysanthemum хризантем по современной классификации видов относят к роду Dendranthema. Для получения каллусных тканей семена хризантемы высаживали на среды МС содержащие 2,4-Д, кинетин, БАП, ИУК в различных комбинациях и концентрациях. Интенсивное каллусообразования наблюдали при добавлении в питательную среду БАП и ИУК. Максимальное каллуссобразование (78,2%) было на среде МС с 1 мг/л БАП и 0,1 мг/л ИУК. Добавление в питательную среду 2 мг/л кинетина в сочетание с различными концентрациями 2,4-Д не привело к интенсификации процесса каллусообразования, частота каллусообразования во всех сочетаниях была менее 40% (рисунки 1 и 2). Для регенерации была подобрана питательная среда ½ МС с 0,5 мг/л БАП, через 2-3 пассажа были получены регенеранты (24,8%). Каллусогенез и регенерация растений осложнялась повышенной чувствительностью каллусов к компонентам среды и pH. При культивировании каллусов более 3 недель происходило потемнение каллуса. Для укоренения растения-регенеранты брахикомы иберисолистной и хризантемы килеватой пересаживали в пробирки на жидкую питательную среду ½ МС с добавлением 0,1 мг/л НУК, корни образовывались через 1-2 пассажа. Таким образом, подобраны среды для каллусообразования, регенерации и укоренения для брахикомы иберелисолистной: каллусообразования на среде В5 с 6 мг/л 2,4-Д и 2 мг/л кинетина, регенерация растений на среде 1/2МС с 0,1 мг/л НУК и 2 мг/л БАП, укоренение на среде с ½ МС с 0,1 мг/л НУК; для хризантемы килеватой – каллусообразования на среде 1 мг/л БАП и 0,1 мг/л ИУК, регенерация на ½ МС с 0,5 мг/л БАП и укоренение на ½ МС с 0,1 мг/л НУК. Рисунок 1 – Регенеранты брахикомы иберисолистной с корнями Рисунок 2 – Частота каллусообразования у хризантемы килеватой в зависимости от вида фитогормонов на среде МС Рисунок 3 – Регенеранты хризантемы килеватой с корнями