Intestinal microbiota as a source of novel biomarkers of ageing

Full Text

Введение В 2013 году в Российской Федерации 32 млн человек имели возраст старше 60 лет; у 72% из них были выявлены те или иные хронические заболеваниями и более 17 млн человек находились на постоянном диспансерном наблюдении. Через 10 лет число таких граждан достигнет 40 млн человек. В отечественной экономике занято около 10 млн лиц пенсионного возраста; еще более 300 тыс. пенсионеров готовы продолжить свою рабочую деятельность. Для этого почти 15% граждан предпенсионного и пенсионного возраста желают пройти дополнительное обучение или повысить квалификацию, получив новые знания и трудовые профессии. В этой связи становится понятным, почему в последние годы в России и в других развитых странах мира растет интерес к выяснению причин старения и каким образом сохранять и улучшать физические и умственные способности пожилых людей. Накопленные данные свидетельствуют, что у лиц с повышением возраста даже при отсутствии заболеваний возникают и постепенно прогрессируют различные физические, метаболические, нервно-психические, клеточные и молекулярные нарушения практически во всех органах и тканях [1; 2]. В настоящее время полагают, что биомаркерами старения могут быть нестабильность геномной и митохондриальной ДНК, нарушение эпиге-номной программы развития, окислительный стресс, хроническое воспаление, укорочение теломер, дисбаланс гомеостаза белков, ускоренное старение клеток, дисфункции митохондрий, дефекты трофических и энергетических сигнальных путей, истощение стволовых клеток, изменение внутриклеточной и межклеточной коммуникации [2-11]. В течение многих лет доминировало мнение, что здоровье, долголетие и риск заболеваний, преимущественно обусловлены дефектами, возникающими в эукариотических клет ках человека. Между тем, в последнее десятилетие возникла и получила все больше подтверждение новая парадигма, предлагающая рассматривать человека, как «суперорганизм», симбиотическое сообщество представителей Eukarya, Bacteriacea, Archaea и Viruses. С этих позиций, симбиотическуюмикроби-оту высших животных организмов рассматривают, как важнейший экстракорпоральный орган этого суперорганизма, как эндогенный эпигеномный фактор, активно участвующий в регуляции роста и развития хозяина, его здоровья и заболеваний [12-15]. Использование классических бактериологических и современных молекулярных «ОМИК»-технологий [16-18] позволило детально исследовать структуру и многочисленные функции симбиотической микробиоты человека на протяжении всей его жизни, с рождения до глубокой старости. При этом оказалось, что микробиота каждого индивидуума имеет уникальный профиль, как по своей структуре [19], так и функциональной активности [20]. У взрослых здоровых людей 80% кишечноймикробиоты принадлежит трем доминирующим (более 109 кое/г) филам: Bacteroidetes, Firmicutes и Actinobacteria, среди которых преобладают определенные виды клостридий(С.ієрШіті, C.coccoides) и представители родов Bacteroidetes, Eubacterium, Bifidobacterium, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Propionibacterium; среди субдоминирующих (менее 109 кое/г) кишечных микроорганизмов наиболее часто обнаруживаются представители Lactobacillus, Proteobacteria, Fusobacterium, Cyanobacteria, Verru-comicrobia, Desulfovibrio, Sporomusa, Apopobium, Methanobrevibacter и ClostridiumlV, XI, XIVb, XVIII групп [15; 21-25]. Попытки использовать микроэкологический профиль пищеварительного тракта в качестве нового биомаркера старения и долголетия в последние годы 40 Нутрициология и лечебное питание Вестник восстановительной медицины № 2·2015 предпринимались неоднократно. Биоматериалом для таких исследований обычно служили фекалии людей, которые подвергались традиционному микробиологическому анализу и/или молекулярно-генетическому изучению [16-20; 26-33]. К сожалению, опубликованные к настоящему времени данные, касающиеся сравнительного состава микробиоты у лиц различного возраста, достаточно противоречивы. Это дало основание утверждать, что наши знания роли кишечного микробиома человека, как эндогенного фактора ускоренного старения, метаболических заболеваний или долголетия, пока еще весьма ограничены [13]. Отсутствие единого мнения, какие изменения в кишечной микробиоте человека могут быть объективными биомаркерами старения, обусловлено чрезвычайно сложным и в то же время индивидуальным популяционным составом этой микробиоты. Кроме того, на результаты исследований существенное влияние оказывал разноречивый по возрасту состав обследованных групп, отсутствие коммерческих стандартных тест-систем, позволяющих объективно сравнивать структуру их кишечной микробиоты. Присутствие хронических заболеваний, использование для их лечения множества лекарственных средств, особенности пищевого рациона, малоподвижный образ жизни, другие физиологические и социально-психические особенности также являлись факторами, затрудняющими сравнительную оценку микроэкологического статуса у представителей этой категории населения [16; 18; 20; 30]. Хотя причинная связь возрастной сукцессии кишечной микробиоты со старением и/или долголетием человека, до настоящего времени окончательно не установлена, микроэкологические подходы к ее пониманию могут послужить отправной точкой для разработки новых и совершенствования имеющихся программ сохранения активного долголетия и восстановительной медицины [35-37]. Является доказанным, что кровь человека несет широкий спектр биомолекул, включая нутриенты, гормоны, метаболиты и другие низкомолекулярные соединения, являющиеся структурными компонентами или секретируемые различными клетками суперорганизма [13; 38-42]. Более 40% всех этих соединений, обнаруживаемых в крови, имеют микробное происхождение [40; 43]. Липидный состав микроорганизмов достаточно специфичен для таксонов различного уровня (семейств, родов и даже видов). Знания структуры и количественного состава высших жирных кислот, алкоголей, стеринов и других липидных соединений в клеточной стенке определенных микроорганизмов позволяет использовать метод газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХМС) не только для определения указанных маркерных веществ в исследуемом биоматериале, но и устанавливать таксономическую принадлежность микроорганизмов, присутствующих в биосубстрате, взятом для изучения. ГХМС анализ, использованный нами в данной работе, основан на прямом извлечении липидных соединений из цельной крови, их разделении на газовом хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения и последующей идентификации по площадям пиков и времени их выхода на масс-спектрометре. Предлагаемый метод обеспечивает возможность детектирования одновременно порядка 60 микроорганизмов при проведении анализа одного образца [44-49]. Нами впервые предпринята попытка оценить профиль пристеночной микробиоты кишечника у лиц пожилого и преклонного возраста путем ГХМС анализа крови на содержание в ней 126 высших жирных кислот, гидрокси-кислот, спиртов, альдегидов и стеринов, специфических для различных таксономических групп микроорганизмов. Материалы и методы Объектом исследования являлись 41 человек зрелого/пожилого - 45-59 лет (17 чел) и преклонного -75-90 лет (24 чел) возраста, отобранных методом случайной выборки. Материалом для исследования служила цельная кровь, взятая у них из вены, которую отбирали в пробирку с ЭДТА, замораживали при -18оС и транспортировали в лабораторию в течение 30-60 минут после взятия материала. Кровь отбирали согласно Методическим указаниям «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории» МУ 4.2.2039-05 пункт 3. Доставленные пробы подвергали анализу на состав микробных маркеров с использованием хромато-масс-спектрометра АТ 5973 (газовый хроматограф с масс-селективным детектором серийного выпуска; Agilent Technologies Inc, США). Суть анализа состояла в прямом извлечении с помощью экстракции жирнокислотных соединений из образца крови, их разделения на хроматографе в капиллярной колонке и анализа состава на масс-спектрометре. Цельную кровь (40 мкл) переносили в виал, емкостью 1,5 мл, с завинчивающейся крышкой и с тефлонированной прокладкой, подсушивали (при снятой крышке) в термостате при 80оС с добавлением 40 мкл метанола для ускорения сушки. К загустевшей пробе приливали 400 мкл 1М соляной кислоты в метаноле; кислый метанолиз вели при 80оС в течение 60 минут. К охлажденной реакционной среде добавляли 300 нг стандарта (дей-терометиловый эфир тридекановой кислоты), растворенного в гексане. Экстракцию проводили дважды путем внесения гексана (по 200 мкл) и последующего встряхивания смеси на вортексе, каждый раз позволяя реакционной смеси отстояться в течение 5 мин при комнатной температуре. Объединенный экстракт высушивали 5-7 мин при 80оС, а затем обрабатывали 20 мкл Ы,О-бис (триметилсилил)-трифторацетамида в течение 15 мин при той же температуре и при закрытой крышке. К реакционной смеси добавляли 80 мклгексана, после чего проба была пригодна для анализа на АТ 5973 в течение недели. Для отнесения маркеров к конкретным микроорганизмам наряду с авторскими данными (740 штаммов микроорганизмов) использована база данных (2000 штаммов) прибора Шерлок (MIDI Inc, Delaware, USA) для хроматографической идентификации микроорганизмов по жирным кислотам, а также другие литературные источники. АТ 5973 снабжен компьютером с соответствующими программами автоматического анализа и обработки данных; сам процесс анализа занимает 30 мин, а с учетом времени пробоподготовки и расчета данных - не более 3 часов. Расчет концентрации маркеров и отнесение их к конкретным микроорганизмам проводили по программному продукту, поставляемому разработчиком. Результатом проведенных ГХМС исследований являлось установление маркеров, позволяющих судить о структуре и количественном содержании в пристеночной микробиоте кишечника обследуемых представителей 57 различных таксономических филотипов микроорганизмов. Нутрициология и лечебное питание 41 Вестник восстановительной медицины № 2^2015 [45; 50; 51]. Статистическую обработку результатов одноименных показателей в каждой группе сравнения проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 для Windows. Различия в показателях считались достоверными, если они не менее, чем в два раза, отличались от референсных значений, полученных при обследовании крови здоровых молодых людей. Результаты и их обсуждение В таблице приведены данные ГХМС исследований крови 41 человека, касающиеся содержания 25 представителей пристеночной микробиоты кишечника у лиц зрелого/пожилого и преклонного возраста. Анализ этих данных свидетельствует о достаточной индивидуальности исследованных людей по структуре и количественному содержанию изученных таксонов бактерий, грибов и вирусов. При обсуждении микроэкологического профиля кишечника зрелых, пожилых и преклонных людей немаловажным является терминологическое определение понятия «старый» человек. По данным итальянских исследователей состав и функции микрофлоры толстой кишки у пожилых людей в среднем возрасте 70 лет относительно мало отличались от таковых взрослых молодых здоровых людей, что с микроэкологи-ческой точки зрения позволило ввести даже такое понятие, как задержанное старение («delayed aging»). Лишь у лиц старше 80-90 лет (centenarians) наблюдались отчетливые различия в структуре и функциях микробиоты толстого кишечника [30]. Соотношение микроорганизмов, входящих в филогруппы Firmicutes и Bacteroidetes в содержимом толстой кишки у новорожденных, взрослых и пожилых людей составляет 0,4; 10,9 и 0,6, соответственно [29]. К особенностям фекальной микробиоты лиц старших возрастных групп относят наличие в этом биоматериале повышенного количества оппортунистических патогенов (энтеробактерий, кандида, стафилококков) с одновременным уменьшением у старых и людей преклонного возраста бифидобактерий, появление в фекалиях достаточно большого числа атипичных вариантов доминирующих и субдоминирующих представителей симбиоти-ческоймикробиоты, изменение соотношения лакта-тобразующих и бутиратсинтезирующих анаэробных бактерий. Какие-либо специфические маркерные виды микроорганизмов в фекалиях, характерные только для долгожителей (лиц старше 90 лет), не были обнаружены [16; 19; 30; 31]. Из наших данных, представленных в таблице, видно, что в группе лиц в возрасте 45-59 лет наибольшие отклонения (в два и более раз) от референсных значений (здоровые взрослые люди), отмечались последующим таксономическим микробным филотипам: Eubacterium lentum, Peptostreptococcus anaerobius, Streptococcus mutans, Bifidobacterium, Propionibacterium/ Clostridium subterminale, Herpes-вирусам. При этом отмечалось как некоторое увеличение числа условнопатогенных микроорганизмов и вирусов, так и снижение представителей «полезной» микробиоты; к последним относят, прежде всего, бифидобактерии и лактобациллы [13].В группе людей в возрасте 75-90 лет наибольшие различия с референсными значениями имелись по представителям Lactobacillus, Eubacterium/Clostridium coccoides, Bifidobacterium, Propionibacterium/Clostridium subterminale. Дефицит Bifidobacterium, Propionibacterium/ C.subterminale наблюдался в обеих возрастных группах. В более старшей возрастной группе в пристеночной микробиоте снижалось разнообразие филотипов как «полезных», так и условно-патогенных микроорганизмов, что совпадает с результатами наблюдений за структурой фекальной микробиоты у лиц старше 75 лет [16; 30; 31]. Связано ли это с особенностями питания этих лиц, «скудным» образом их жизни, или со старением организма, как биологическим процессом в целом, пока сказать невозможно. Хотя иммунная устойчивость лиц в группе 75-90 лет ниже, чем у более молодых людей [16], способность человека в этом возрасте выстраивать новые симбиотические взаимоотношения с возраст-трансформированной пристеночной кишечной микробиотой может быть важнейшим условием их долголетия. Использованная нами в работе ГХМС технология позволяла также определять в крови обследуемых лиц содержание эндотоксина и плазмалогена. Как известно, эндотоксин (микробный липополисахарид) является одним из важнейших факторов хронического воспаления, которое по последним данным [3; 9; 30], в значительной степени ответственно за ускоренное старение и развитие метаболических заболеваний, связанных с пожилым возрастом. Источником эндотоксина в организме млекопитающих являются грамотрицательные патогенные и оппортунистические бактерии, в первую очередь, энтеробактерии и бактероиды, широко представленные в составе фекальной микробиоты и, количество которых увеличивается с возрастом [16; 19; 30; 31]. Следует заметить, что некоторые исследователи [29] отмечали заметное снижении пропорции представителей фила Bacteroides в общей массе фекальных микроорганизмов. По нашим данным, содержание эндотоксина в крови лиц 45-50 лет составляло 0,54 ± 0,22 мкг/мл, что было близким к референсным значениям для здоровых взрослых людей. Троекратно сниженное количество эндотоксина (0,18±0,07 мкг/мл) в крови у лиц старше 75 лет согласуется с нашими наблюдениями, что содержание грамотрицательных бактерий в пристеночном слое нижних отделов тонкого кишечника было крайне незначительно. Плазмалогены (плазменил-, плазманил-липиды) - это фосфолипиды/гликолипиды, широко представлены в клетках млекопитающих и у анаэробных бактерий. Кишечная микробиота является дополнительным (а возможно и основным) резервуаром плазмалогенов, поскольку эти соединения в значительном количестве синтезируются и присутствуют в составе мембран многих анаэробов (эубактерии, бифидобактерии, пропионобактерии, клостридии, бактероиды, десульфовибрио, румино-кокки, вейллонеллы, пропионибактерии, мегасфера и др.). В растениях и грибах плазмалогены не встречаются [52-54]. Плазмалогены защищают от окисления полиненасыщенные жирные кислоты, участвуют в структуре и функциях мембран клеток млекопитающих и анаэробных бактерий, осуществляют межклеточные сигнальные функции и т.д. Хотя плазмалогены бактерий и эукариотических клеток функционально схожи, структурно они существенно различаются. Содержание плазмалогена в тканях мозга и биологических жидкостях существенно снижено у больных с неврологическими заболеваниями, связанными со старением, включая деменцию по типу болезни Аль-цгеймера[53]. Данные наших исследований пока- 42 Нутрициология и лечебное питание Вестник восстановительной медицины № 2·2015 зали, что содержание бактериального плазмалогена в крови составляло 21,73±12,93 и 6,47±3,56 мкг/ мл в первой и второй возрастных группах соответственно, что два - семь раз ниже референсного значения (50 мкг/мл). Это позволяет рассматривать плазмалогены, как дополнительный биомаркер старения/ долголетия, в поддержании уровня которого анаэробная кишечная микробиота, синтезирующая данную группу липидов, может активно участвовать. Представленные в настоящем исследовании данные позволяют нам рекомендовать выявленные изменения в структуре филотипов пристеночной кишечной микробиоты,как четкие, воспроизводимые возраст -ассоциированные микроэкологические маркеры старения, а сам метод ГХМС как быструю технологию оценки профиля состава пристеночной микробиоты кишечника у людей зрелого/пожилого и преклонного возраста. Заключение Объектом наших исследований являлась кровь лиц зрелого/пожилого и преклонного возраста, которую можно рассматривать как интегральный биоматериал, вобравший в себя соответствующие низкомолекулярные соединения (потенциальные микробные маркеры) на всем протяжении пищеварительного тракта. Спектр и количество низкомолекулярных субстанций (высшие жирные кислоты, спирты, альдегиды, эндотоксин, плазмалогены и др.) микробного происхождения в крови зависят от многих факторов: их способности преодолевать барьер слизистой кишечника и транслоцироваться в кровяное русло, возможностью и скоростью их утилизации в просвете кишечника эпителиоцитами и симбиотическими микроорганизмами кишечника, пропорционального содержания кишечных бактерий в структуре микробиоты в различных биотопах пищеварительного тракта, их локализацией в пристеночном (фик-сированномсостоянии) или в просвете кишечника (в плавающем состоянии). Дальнейшие исследования позволят установить, какие из перечисленных условий и в какой мере могут влиять на конечные результате ГХМС анализа крови, позволяющие установить микроэкологический профиль кишечника людей различного возраста. Наблюдения авторов первого применения ГХМС для оценки микробной экологии пищеварительного тракта человека [46; 51], также как и наши данные, позволяют говорить, что эта технология способна достаточно объективно отобразить состояние пристеночной микробиоты в нижних отделах тонкой кишки (тощая, подвздошная) и начале толстой кишки (слепая кишка). Прямое сопоставление наших данных и результатов, полученных при исследовании фекалий вряд ли возможно и целесообразно, поскольку они направлены на изучении микробной экологии разных отделов пищеварительного тракта. Скорее следует говорить, что ранее опубликованные и наши данные информационно дополняют друг друга и расширяют наши знания, касающиеся микроэкологической характеристики пищеварительного тракта. Расширение спектра образцов биоматериала, взятых из различных отделов кишечника, и одновременное их исследование бактериологическим, молекулярно- генетическим, ГХМС и другими ОМИК-методами, дадут возможность более объективно оценивать состав и количественное содержание как доминирующих, так и минорных представителей микробиоты пищеварительного тракта на всем его протяжении у лиц, принадлежащих различным возрастным группам [17]. Знания динамики и механизмов становления микробиоты в детстве и ее сукцессии в течение всей индивидуальной жизни (включая пожилой и преклонный возраст) создадут реальные предпосылки восстановления микроэкологического статуса конкретного человека в определенных условиях его жизни с использованием пробиотиков, пребиотиков,метабиотиков и синбиотиков [15; 36; 37]. Оригинальным и перспективным микроэкологи-ческим подходом поддержания здоровья и активного долголетия может стать также создание на территории РФ национальных криогеных банков с целью сохранения биоразнообразия кишечной микробиоты многочисленных этносов россиян и отдельных их представителей. На базе сохраняющихся при температурах от -80оС до -196оС (практически вечно) в неизменном состоянии индивидуальных симбиотических ассоциаций бактерий можно будет создавать аутопробиотики (пробиотики индивидуального применения) для аутотрансплантации кишечной микробиоты, которую, возможно, надо будет рекомендовать всем лицам, перешагнувшим возраст 45-50 лет [1; 55]. Внедрение в практику восстановительной медицины микроэкологической инженерии (направленное восстановление микробиоты людей пожилого и преклонного возраста) путем своевременного назначения им замороженной аутомикробиоты, взятой на хранение в молодом возрасте, открывает новые захватывающие перспективы в области создания программ активного долголетия. Выводы Использование метода хромато-масс-спектро-метрии крови позволило установить структуру и количественный состав пристеночной кишечной микробиоты у людей в зрелом, пожилом и преклонном возрасте. У обследованных групп выявлены различия в содержании определенных таксономических микробных филотипов в микробиоте кишечника, а также в количестве эндотоксина и бактериального плазмалогена в плазме крови; особенно четко эти различия выявлялись у людей старше 75 лет. Метод ГХМС крови может быть рекомендован в качестве экспрессной технологии оценки профиля состава пристеночной микробиоты кишечника людей пожилого и преклонного возраста. Выявляемые микроэкологические различия могут рассматриваться в качестве биомаркеров старения и долголетия. Авторы выражают благодарность доктору биологических наук Терешиной Е.В. за возможность получения биоматериала от людей старших возрастных групп. Нутрициология и лечебное питание 43 Вестник восстановительной медицины № 2·2015 Таблица. Содержание некоторых представителей кишечной микробиоты у лиц различных возрастных групп 44 Нутрициология и лечебное питание

About the authors

S. L Bezrodny

Moscow Research Institute of Epidemiology & Microbiology after G.N.Gabrichevsky

Email: frebiotik@mail.ru

B. A Shenderov

Moscow Research Institute of Epidemiology & Microbiology after G.N.Gabrichevsky

Email: shenderof@yandex.ru

References

Supplementary files