Radioprotective and antioxidant properties of the gel from brown algaE

Full Text

Введение Бурые морские водоросли становятся все более перспективным сырьем для производства фармакологически активных средств. Они богаты минеральными веществами (йод, кальций, магний, железо), содержат уникальные полисахариды (альгиновая кислота, ламинаран, фукоидан) и антиоксиданты (фукоксантин, порфирины), что особенно актуально в условиях несбалансированного рациона и дефицита микроэлементов, в том числе эссенциальных [1]. Проведенные исследования выявили противоопухолевую активность фукои - дана и возможность его использования в комплексной терапии вирусных гепатитов [2, 3]. Изучено его противовоспалительное действие при ишемии печени, почек и сердца после трансплантации [4]. В ряде исследований доказано антиоксидантное действие фукоидана [5, 6]. Фукоидан является сульфатированным полисахаридом, близким по структуре и свойствам гепарину, широко применяемому антикоагулянту [7]. Безусловно, дальнейшие исследования полисахаридов бурых морских водорослей представляются перспективными. Научный поиск распространяется не только на попытки выделения монопрепаратов из всего биологического многообразия состава исходного сырья, но и аутолизаты, сохраняющие природное многообразие биологически активных веществ. Известно, что различные морские водоросли еще с давних времен использовали не только как пищевой продукт, но и как эффективное средство для лечения и профилактики многих заболеваний. Основной полез ной составляющей морских водорослей является аль - гиновая кислота, которая была открыта английским химиком T.C. Stanford в 1881 г. как побочный продукт при получении из них йода. Спустя несколько лет ее обнаружил Крефтинг и назвал эту кислоту водорослевой. В настоящее время в мире производится 250 - 300 наименований продуктов из альгиновой кислоты и ее солей [8]. Альгиновые кислоты представляют собой полисахариды, образованные из остатков ß - D - маннуроновой и а - L - гулуроновой кислот (рис. 1), находящихся в пира - нозной форме и связанных в линейные цепи гликозид - ными связями. Соотношение между мономерами меняется в широких пределах в зависимости от источника. Распределение мономеров вдоль цепи носит блочный характер. Представлены блоки трех типов: монотонные последовательности остатков в - D - маннуроновой или a - L - гулуроновой кислоты и участки с более или менее регулярным чередованием остатков обеих кислот. Блоки, построенные из полиманнуроновой кислоты, придают вязкость альгинатным растворам, блоки гулуроновой кислоты ответственны за силу геля и специфическое связывание двухвалентных ионов металлов. От соотношения мономеров и их распределения внутри цепей зависит структура альгинатов. Альгинаты представляют собой аморфные бесцветные или слабо окрашенные вещества с молекулярной массой 35 000 - 1 500 000. Плохо растворимы в холодной воде (при набухании могут поглощать 200 - 300 - крат - Профессиональное пространство. Хроника жизни. Люди и организации 89 Вестник восстановительной медицины № 6 • 2015 ное количество воды), растворимы в горячей воде и растворах щелочей; при подкислении растворы образуют гели. Альгинаты можно получать более чем из 300 видов бурых водорослей, структурными элементами клеточных стенок которых они являются, в частности из Laminaria hyperborea, Macrocystis pyrifera и Ascophyllum nodosum, в меньшей степени из L. digitata, L. japonica, Ecklonia maxima, Lessonia nigrescens и некоторых видов Sargassum [9]. Альгиновые кислоты и альгинаты обладают рядом особенностей, позволяющих использовать их в медицине: - ионообменные свойства, лежащие в основе защиты организма от солей тяжелых металлов; - способность элиминировать радионуклиды; - противоаллергическое и иммуномодулирующее действие, связанное с возможностью сорбировать иммунные комплексы, иммуноглобулин Е, стимулировать секрецию иммуноглобулина А; - способность восстанавливать функциональную активность макрофагов, обеспечивая их антимикробную, противогрибковую и противовирусную активность; - выраженный регенеративный и цитопротективный эффект для поврежденных тканей; - антирефлюксное действие; - высокая сорбционная активность; - способность восстанавливать и стимулировать перистальтику кишечника; - обволакивающее действие за счет разбухания в просвете желудочно - кишечного тракта; - слабый осмотический слабительный эффект [10]. Технология получения альгинатных гелей и чистой альгиновой кислоты, созданная T.C. Stanford в 1881 г. [8] принципиально не меняется до настоящего времени. Получение альгиновой кислоты и альгината натрия включает 2 - 3 разовое промывание водорослей, их измельчение до размера 3 см2 и обработку соляной или серной кислотой в течение 3 - 4 ч при постоянном перемешивании. Далее в промытые водоросли добавляется 10 частей воды и 5 - 10% соды (карбоната натрия), смесь нагревается до 40°С и выдерживается при постоянном перемешивании 2 ч. В результате получается клееобразная густая паста - галерта, которая разводится 10 объемами воды для снижения вязкости, барботируется газообразным кислородом, то есть осуществляется процесс газовой флотации для очистки массы от взвешенных частиц. Полученный раствор альгината натрия отбеливается гипохлоритом натрия; затем очищенный и отбеленный раствор альгината натрия обрабатывается серной или соляной кислотой при рН 3 в течение 2 ч. до образования геля альгиновой кислоты. Обезвоженная на центрифугах альгиновая кислота нейтрализуется едким натром или карбонатом натрия. По окончании нейтрализации образуется гель альгината натрия, который обезвоживается и сушится [11]. Технологический процесс получения альгинатов стал прототипом получения различных средств для диетического и лечебного питания на базе бурых морских водорослей. Одним из них является гель из гомогенизированных бурых водорослей с размером частиц не более 500 мкм, содержанием йода не менее 15 мг/кг и углеводных фракций: маннит - 133,4±12,1 мг/г, альгиновая кислота - 147,8±10,7 мг/г. Прием геля обеспечивает за счет антиоксидантного и иммуномодулирующего действия восстановление нарушенного метаболизма, выведение из организма токсических веществ при заболеваниях желудочно - кишечного тракта, сердечнососудистой и эндокринной систем [12, 13]. Разработан технологический процесс производства геля из бурых морских водорослей [14]. Современные подходы к установлению механизма окислительно - восстановительных реакций, инициированных действием стрессовых факторов, включая ионизирующее излучение, на различные биологические системы разной степени организации напрямую связаны с изучением влияния на них присутствия молекулярного кислорода различных антиоксидантов, сенсибилизаторов и ингибиторов. В конце XIX столетия А.Н. Бах, К. Энглер и В. Вилд впервые сформулировали основные положения перекисной теории окислительных процессов [15, 16]. Изучению сложного механизма процессов биологического и каталитического окисления были посвящены работы последователей и учеников А.Н. Баха. Общая теория цепных окислительных реакций, созданная акад. Н.Н. Семеновым, явилась важным этапом в дальнейшем развитии теории окисления органических соединений [17]. Исследования в области кинетики цепных реакций теория жидкофазного окисления нашла глубокое развитие в трудах ученых школы академика Н.М. Эмануэля [18]. В связи с острой необходимостью в понимании и установлении механизма сложных процессов, происходящих в различных системах при воздействии ионизирующего излучения, были созданы новые научные направления - радиационная химия, радиобиология, и другие. Первая группа исследователей в этой области появилась по инициативе А.Н. Фрумкина в 1946 г. в Институте физической химии. Срочное решение фундаментальных и прикладных задач в области радиационной химии и радиобиологии потребовало создания специальных источников ионизирующего излучения, включая импульсные ускорители, разработок скоростных методов детектирования промежуточных активных частиц в различных модельных системах [19, 20]. Использование метода импульсного радиолиза со скоростным детектированием (спектрофотометрическим) промежуточных частиц окисления органических соединений в жидкой фазе позволило идентифицировать алкильные Rj, пероксидные радикалы RO2, супероксид анион - радикалы О2 - / и короткоживущие продукты их взаимодействия с ингибиторами, антиоксидантами: металлокомплексами порфиринов, фта - лоцианинами, каротиноидами, пептидами, флавонои - дами [21]. Следует обратить особое внимание на то, что выводы о полифункциональной активности многих природных антиоксидантов, радиопротекторов, о направлении окислительно - восстановительных реакций в модельных системах под действием ионизирующего излучения или при электрокаталитических процессах можно сделать только на основе включения в схему реакций окисления данных о первичных стадиях взаимодействия короткоживущих продуктов с молекулами введенных добавок [22]. Несмотря на то, что импульсные методы генерирования активных частиц (импульсный радиолиз) и синхронизированные скоростные методы детектирования образующихся продуктов сегодня в нашей стране недоступны, проблема радиационной безопасности, радиационной стабильности материалов, защиты населения от патогенного воздействия окружающей среды остается крайне актуальной. Поэтому научные иссле 90 Профессиональное пространство. Хроника жизни. Люди и организации Вестник восстановительной медицины № 6 • 2015 дования, связанные с изучением радиационной стабильности лекарственных препаратов, пищевых продуктов, особенно вновь созданных, остаются в центре внимания. Основные задачи связаны с возможностью моделирования и изучения с помощью радиационнохимических методов и подходов механизма окислительно - восстановительных реакций в различных биологических системах и влияния на них препаратов, обладающих антиоксидантной, радиопротекторной и протекторной активностью при использовании стационарных источников облучения [23]. Материалы и методы В процессе проведения исследования готовились образцы для изучения радиационной устойчивости биологических препаратов из бурых водорослей: образцы геля и растворов экстрактов водорослей в ацетоне. Затем измерялись спектры оптического поглощения исходных образцов, и оценивалась их стабильность. На следующем этапе изучался состав возможных соединений в ацетоновом растворе экстракта водорослей. После этого проводилось облучение подготовленных образцов на РХМ - у - 20 установке Российского химикотехнологического университета имени Д.И. Менделе ева. Доза облучения составила от 0,18 кГр до 22 кГр. Дозиметрия проведена ферросульфатным методом с использованием дозиметра Фрикке, мощность дозы равна 0.13±0.01 Гр/с. Затем определялась степень превращений компонент водорослей, имеющих характерные полосы оптического поглощения, из расчёта изменения оптических плотностей при соответствующих максимумах поглощения с использованием прибора СФ - 2000, кварцевые кюветы, длина оптического пути 1мм и 10 мм. Результаты и их обсуждение На рис. 1 представлены исходные спектры оптического поглощения экстракта водорослей в ацетоне. При длине оптического пути 1=1 мм зарегистрирована полоса в ультрафиолетовой области, которая отнесена к активным пигментам, по - видимому, каротино - идам. Далее на рис. 2 для более детальной картины в видимой части спектра были сняты спектры при длине оптического пути 10мм. На спектре оптического поглощения зарегистрированы максимумы полос поглощения в видимой области спектра. Выделены следующие явные максимумы: 410 нм, 504 нм, 537 нм, 611 нм, 668 нм. А, отн. ед. Рис. 1. Исходный экстракт водорослей в ацетоне относительно ацетона. Длина оптического пути 1 мм. w І н о _Û I- о 0 1 I- о с сс CÜ о ф с о 400 450 500 550 600 650 700 750 800 длина волны, нм Рис. 2. Исходный экстракт водорослей в ацетоне относительно ацетона. Длина оптического пути 10 мм. Профессиональное пространство. Хроника жизни. Люди и организации 91 Вестник восстановительной медицины № 6 • 2015 По литературным данным известно [24, 25], что в ламинарии находятся хлорофиллы а, с1,с2 и кароти - ноиды фукоксантин, виолаксантин, в - каротин. Хлорофиллу принадлежат полосы поглощения 457, 588, 633 и 668 нм, кроме того полоса 611нм, вероятно, относится к колебательному обертону полосы 668нм; каротинои - дам принадлежат полосы электронных переходов при 466, 510, 548 нм. Известно, что под действием стрессовых факторов (радиация, физические, химические, биологические воздействия окружающей среды и др.) образуются свободные радикалы и их токсичные продукты, способные вызывать повреждения функционально важных молекул. В химии высоких энергий в качестве модели окислительного стресса применяют воздействие ионизирующего излучения на системы. Применение метода радиационно - химического моделирования реакций позволило изучить радиолиз экстрактов бурых водорослей и прогнозировать их антиоксидантные свойства. Данный метод не требует больших затрат времени, денег, в отличие от биологических испытаний. Исследование по влиянию дозы ионизирующего излучения на экстракты морепродуктов в ацетоне проведено в интервале доз от 0.5 кГр до 10 кГр в аэрированных условиях. Спектры оптического поглощения сняты через 5 - 10 минут после достижения растворами заданной дозы. На рис. 3 представлены изменения спектров оптического поглощения аэрированных экстрактов водорослей в ацетоне в зависимости от дозы. Интенсивность полос поглощения аэрированных растворов в ацетоне оказалась различной. На рис. 4 представлено изменение оптической плотности водорослей в ацетоне в аэрированных условиях от дозы при следующих длинах волн: 668 нм, 504 нм, 611 нм, 537 нм. В ацетоне пигменты оказались радиационно - устойчивы к действию излучения до дозы 1 кГр, после чего наблюдалось резкое увеличение радиационной чувствительности, особенно при длине волны 667,7 нм, которая принадлежит к хлорофиллу, а именно хлорофиллу а. Исходя из структуры хлорофилла а, приведенного на рис. 5, можно сделать предположение, Рис. 3. Изменения спектров оптического поглощения аэрированных эсктрактов водорослей в ацетоне в зависимости от дозы (кГр): 1 - 0; 2 - 0.5; 3 - 1; 4 - 9; 5 - 10.3. D А доза, кГр Рис. 4. Изменение оптической плотности водорослей в ацетоне в аэрированных условиях от дозы при следующих длинах волн (нм): 1 - 668, 2 - 504, 3 - 611,4 - 537. 92 Профессиональное пространство. Хроника жизни. Люди и организации Вестник восстановительной медицины № 6 • 2015 что его разрушение происходит за счет восстановительных радикалов, образующихся только после полного исчерпания растворенного кислорода, что и обуславливает наличие индукционного периода. После восстановления (или присоединения по двойным связям) происходит изменение конформации молекулы, в результате чего она утрачивает возможность удерживать центральный ион магния и таким образом происходит разрушение хромофорного центра. Разрушение каротиноидов происходит восстановительными радикалами хлорофилла (полоса электронного поглощения 510 нм). Для подтверждения этих выводов необходимо произвести облучение экстрактов при условиях насыщения инертным газом (аргоном) и при условиях насыщения закисью азота. Кроме того, было бы целесообразным разделить хлорофилл и каротиноиды для изучения их радиационных превращений в индивидуальном состоянии, а так же изучить их взаимное влияние для возмож ного усиления антирадикальной активности экстрактов. Для исследования радиационной устойчивости геля, полученного из бурых водорослей, проведено изучение распределение частиц экстракта на приборе Analysette 22 NanoTec. Было показано, что воздействие ионизирующего излучения дозой 30 кГр не привело к значительным изменениям в распределении по размерам частиц геля, что представлено на рис.6. Следовательно, дезагрегации частиц геля не выявлено. Однако в спектральных характеристиках геля протекают изменения. Для проведения спектрофотометрических исследований по радиационной устойчивости экстракт морепродуктов в виде геля центрифугировали 8000 оборотов 30 минут. Измерения проведено относительно дистиллированной воды, длина оптического пути 10 мм (рис. 7, рис. 8). Из диаграмм следует, что экстракты чувствительны к действию ионизирующего излучения. Степени превра - Рис. 5. Структура хлорофилла. % Размер частицы, мкм Рис. 6. Распределение частиц по размерам. 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 длина волны,нм А А Рис. 7. Изменения спектров оптического поглощения экстрактов бурых водорослей в виде геля в зависимости от дозы (кГр): 1 - исходный; 2 - 0.18; 3 - 0.38; 4 - 0.57; 5 - 0.76; 6 - 0.95; 7 - 22. Профессиональное пространство. Хроника жизни. Люди и организации 93 Вестник восстановительной медицины № 6 • 2015 щения рассчитаны из изменения значений оптических плотностей при длинах волн, равных 410 нм и 672.6 нм, соответственно. Надо отметить, что при воздействии ионизирующего излучения дозой 0.18 кГр степени превращения равны 1,1 % (410 нм) и 12,5 % (672,6 нм). Полоса поглощения при 410 нм более радиационно устойчива, приблизительно в 10 раз. При дальнейшем влиянии радиации на систему степени превращения отличаются приблизительно в 2 раза, при 672,6 нм полоса более радиационно - чувствительна (рис. 9). Выводы Полученные спектрофотометрические данные позволяют сделать вывод о том, что при воздействии радиации при относительно невысоких дозах (до 10 кГр) наблюдаются заметные деструктивные процессы в экстрактах водорослей в ацетоне. Исследования показывают высокую акцепторную способность по отношению к активным промежуточным продуктам радиолиза соединений, которые входят в состав водорослей. Полосы поглощения «новых продуктов» не детектируются. Кинетические параметры процессов радиолиза в ацетоновых экстрактах водорослей и образцов гелей отличаются. Полученные предварительные данные позволяют подтвердить вывод о высокой радиопротекторной активности геля, полученного из бурых морских водорослей. Ценные компоненты, которые присутствуют в водорослях, представляют большой интерес для дальнейших исследований и создания специализированных медицинских препаратов и других средств для лечебного и профилактического применения. А А D, Гр Рис. 8. Изменение оптической плотности экстрактов в виде геля, полученных из бурых водорослей, в зависимости от дозы при следующих длинах волн (нм): 1 - 410; 2 - 672,6. Степень превращения, % 0 0,18 0,38 0, 57 0,76 0,95 22 доза, кГр а) измерения при длине волны 410 нм Степень превращения, % 0 0,18 0,38 0, 57 0,76 0,95 22 доза, кГр б) измерения при длине волны 672,6 нм Рис. 9. Степени превращения экстрактов из геля, полученного из бурых водорослей, от дозы облучения. 94 Профессиональное пространство. Хроника жизни. Люди и организации

About the authors

A. G Odinec

«Institute of medical-biological problems» RAS

Moscow, Russia

O. I Orlov

«Institute of medical-biological problems» RAS

Moscow, Russia

V. K Il’in

«Institute of medical-biological problems» RAS

Moscow, Russia

A. A Revina

«Russian chemical-technological University n.a. D.I. Mendeleev»

Moscow, Russia

I. G Antropova

«Russian chemical-technological University n.a. D.I. Mendeleev»

Moscow, Russia

A. A Fenin

«Russian chemical-technological University n.a. D.I. Mendeleev»

Moscow, Russia

L. V Tatarinova

All - Russian public organization «Russian society of physicians for regenerative medicine, medical rehabilitation, physiotherapy and balneology»

Email: homee-mail@mail.ru
Moscow, Russia

A. S Prokof’ev

«Moscow State medical stomatological University n.a. A.I. Evdokimova»

Moscow, Russia

References

Supplementary files