FLAVONOIDS IN THE GRASS OF TRIBULUS TERRESTRIS L

Abstract

The article presents active parts of Tribulus terrestris L. as a perspective sample for study. We have provided an example of flavonoids determination with high-performance liquid chromatography / MS at the Waters Acquility chromatographer with tandem quadrupolar MS-detector TQD (Waters).

Full Text

Якорцы стелющиеся (Tribulus terrestris L.), семейства парнолистниковые (Zygophyllaceae) - однолетнее коротко опушенное травянистое растение. Стебли простерты по земле, от основания ветвистые, длиной 10-120 (300) см. Листья супротивные, парноперистосложные, длиной 3-8 см, с 6-8 парами мелких продолговатых листочков. Цветки правильные желтые, диаметром до 1,2 см, одиночные, расположены в пазухах листьев. Околоцветник пентамерный, тычинок 10, гинецей ценокарпный из 5 сросшихся плодолистиков. Плод - ценокарпий, распадающийся при созревании на 5 звездчато-расположенных угловатых «плодиков», несущих на спинке 4 длинных, твердых и острых шипа, а также многочисленные бугорки. В южной части ареала якорцы цветут в апреле-мае, близ северной границы - в июне-июле. В благоприятных условиях цветение продолжается все лето и в начале осени. Растение плодоносит с июня-июля до заморозков [1]. Якорцы стелющиеся произрастают обычно в сухих степях на юге европейской части России и стран СНГ (низовья Дона и Волги, Украина, Молдова), а также в полупустынях Средней Азии, в Казахстане, на Кавказе, Алтае, в Восточной Сибири (Даурия). Растения особенно часто встречаются в Сурхандарьинской, Самаркандской и Кашкадарьинской областях Узбекистана, Курган-Тюбинской и Кулябской областях Таджикистана, Чимкентской области Казахстана и в центральных районах республики Тува. В Туве, как и в других районах Сибири, а также в Дагестане якорцы растут в основном вдоль дорог и на сбитых выпасом песчаных почвах в пределах степного пояса. В Чимкентской области и в других районах Южного Казахстана, а также в Узбекистане, Туркмении и Таджикистане якорцы стелющиеся растут преимущественно как сорное растение поливных культур (огурцов, бахчевых культур, помидоров, винограда, хлопчатника и др.). На неполивных землях они отмечены на стойбищах и как рудеральное растение. В высокогорных районах встречаются редко, но в Таджикистане иногда поднимаются до 2800 м над уровнем моря [1]. В траве якорцев стелющихся содержится около 2,8% стероидных сапонинов, таких как протодиосцин и гликозиды диосгенина, тигогенина, рускогенина. Одними из сопутствующих соединений травы якорцев стелющихся являются стерины: стигмастерин, кампестерин, р-ситостерин и стероиды диосгенин, тигогенин, неотигогенин, ямогенин и согласно исследованиям Tian-Shung Wu, Li-Shian Shi, Shang-Chu Ku (Китай) алкалоиды террестрибисамид, трибулустерин, обнаруженные методом масс-спектрометрии [5]. Известно, что в траве якорцев стелющихся также имеются вещества флавоноидной структуры. Для определения данной группы БАВ используют методы ТСХ анализа [4], а также методы УФ-, ПМР-, С-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии [3]. Объектом исследования являлась трава якорцев стелющихся, собранная в различных районах Болгарии, в период плодоношения. Сырье представляет собой смесь бороздчатых стеблей с продолговатыми отдельными листочками сложного парноперистого листа с беловатым опушением, плодов 5-звездчатой формы, с морщинистой оболочкой и острыми твердыми шипами; реже встречаются отдельные сложные плоды с 2 и 4 шипами, цвет стеблей зеленовато-желтый, плодов светло-зеленый, листьев зеленый, запах сырья слабый, специфический. Около 2 грамм сырья (точная навеска), измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, помещали в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 60 мл 70% спирта этилового, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 45 минут. После охлаждения до комнатной температуры фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл так, чтобы сырье не попало на фильтр, фильтр промывали 10 мл 70% спиртом этиловым и доводили объем раствора в колбе тем же растворителем до метки. Для предварительного обнаружения флавоноидов к спиртовому извлечению в пробирку добавляли спиртовый раствор алюминия хлорида и отмечали, что раствор окрашивался в зеленовато-желтый цвет. Флавоноиды в траве якорцев стелющихся определяли методом ультраэффективной жидкостной хроматографии / МС на хроматографе Waters Acquility с тандемным квадрупольным MC-детектором TQD (Waters). Подвижная фаза А (ПФ А). Смесь вода - ацетонитрил (95:5) с муравьиной кислотой. Подвижная фаза В (ПФ В). Ацетонитрил с муравьиной кислотой. Хроматографировали испытуемый раствор и растворы стандартов в следующих условиях: - объем пробы 5 мкл; - колонка 0,21 × 15,0 см Acuility UPLC BEH C18 (1,7 мкм); - температура колонки 35 °С; - скорость потока 0,3 мл/мин; - градиентный режим хроматографирования формируется путем смешивания подвижных фаз А и В по следующей схеме: Время, мин ПФ А, % ПФ В, % 0 95 5 30 50 50 32 0 100 33 95 5 36 95 5 УФ-детектирование проводили в диапазоне 220-500 нм. Масс-спектрометрическую детекцию (МС) проводили в двух режимах: - МС детекция в режиме позитивных ионов (параметры детектора: напряжение на капилляре - +3 кВ; напряжение на конусе - 50 В; температура капилляра 450 °С; температура источника 120 °С; скорость потока осушающего газа 800 л/ч, скорость потока газа в конусе 50 л/ч и сканирование в диапазоне масс от 100 до 1500 ед.); - МС детекция в режиме негативных ионов (параметры детектора: напряжение на капилляре - -3 кВ; напряжение на конусе - -30 В; температура капилляра 350 °С; температура источника 120 °С; скорость потока осушающего газа 500 л/ч, скорость потока газа в конусе 50 л/ч и сканирование в диапазоне масс от 100 до 1500 ед.). В результате анализа исследуемых образцов экстракта якорцев стелющихся получены следующие результаты. На хроматограмме при 360 нм наблюдаются только 3 достаточно интенсивных пика с массами молекулярных ионов в режиме регистрации позитивных ионов, равными 611, 595 и 625, в режиме регистрации негативных ионов - 609, 593 и 623 и с временами удерживания 7,4, 8,8 и 9,1 мин. Пик с временем удерживания 7,4 мин массой 610 является рутином , так как совпадает по спектрам и времени удерживания со стандартом. Пик с временем удерживания 8,8 мин имеет предположительно структуру кемпферол-3-рутинозида, , так как в спектре в режиме регистрации позитивных ионов имеет фрагменты с 287 (Кемпферол) и 449, с потерей масс 148 и 162, аналогичных фрагментации рутина (611 до 303 и 465). Пик с временем удерживания 9,1 мин может иметь одну из структур: так как его молекулярный ион 625 фрагментируется на 479 и 317 (кверцетин, метилированный в одно из 4-х положений: рамнетин, изорамнетин, тамараксетин или азалеатин), что также аналогично фрагментации рутина. Рисунок 1 - Хроматограммы и спектры смеси стандартов в режиме регистрации позитивных ионов Рисунок 2 - Хроматограммы и спектры экстракта якорцев стелющихся в режиме регистрации позитивных ионов Рисунок 3 - Хроматограммы и спектры экстракта якорцев стелющихся в режиме регистрации негативных ионов Вывод Якорцы стелющиеся - перспективное лекарственное растение, для определения доброкачественности лекарственного растительного сырья которого разработана методика определения флавоноидов. Оптимальным условием экстракции флавоноидов из травы якорцев стелющихся является 70% спирт этиловый с соотношением сырья и экстрагента 1:50, измельченность сырья - 2 мм, температурный режим - кипящая водяная баня с обратным холодильником и временем экстракции 45 минут. Флавоноиды в траве якорцев стелющихся определяли и идентифицировали их структуру методом ультраэффективной жидкостной хроматографии / МС на хроматографе Waters Acquility.Установили, что трава якорцев стелющихся содержит флавоноиды: кемпферол, кверцетин, рамнетин, изорамнетин, амараксетин, азалеатин.