VALIDATION ESTIMATION OF BAICALIN DETERMINATION USING PLANAR CHROMATOGRAPHY

Full Text

В настоящее время перспективным и интересным направлением фармацевтической науки и практики с целью последующего клинического использования является изучение биологически активных соединений из лекарственного растительного сырья [1, 2]. Среди таких объектов наше внимание привлек байкалин - основное действующее вещество шлемника байкальского корней. Байкалин представляет собой гликозид с химической формулой C21H18O11. По данным литературы байкалин обладает седативным, противоопухолевым, антиоксидантным, противовоспалительным действиями [3]. Анализ торговых образцов корней шлемника, проведенный с помощью ВЭЖХ, показал, что в них содержится от 7,0 до 8,6% байкалина и от 2,3 до 4,6% вогонозида, а также агликоны байкалеин и вогонин [4]. Целью работы явилась разработка и валидационная оценка доступной, достаточно эффективной и чувствительной методики идентификации и количественного определения байкалина. Для реализации поставленной цели использовали метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии. Метод фармакопейный, востребованный и не требует сложного аппаратурного оснащения, а также по аналитическим характеристикам не уступает методу ВЭЖХ [5]. Приготовление раствора байкалина: около 0,05 г (точная навеска) стандартного образца (СО) байкалина (Sigma-Aldrich 95%) помещали в мерную колбу вместимостью 50,0 мл, добавляли около 30 мл 70% спирта этилового, нагревали раствор на водяной бане до растворения порошка при перемешивании, охлаждали до комнатной температуры, а затем доводили объем раствора спиртом до метки (концентрация 1 мкг/мкл). Хроматогафирование проводили на пластинках марки Silufol, Sorbfil (ПТСХ-АФ-В-УФ) и Sorbfil (ПТСХ-П-А-УФ). Наиболее эффективными оказались пластинки для высокоэффективной хроматографии Sorbfil (ПТСХ-АФ-В-УФ), число теоретических тарелок 170. Исследуемые системы растворителей: бензол - EtAc - HCOOH (3:1:0,05); AmOH - MeOH - HCOOH - H2O (7:1:1:1); бензол - МеОН - бутанон - НСООН (14:2:3:1); н-бутанол - СН3СООН- H2O (4:1:1). Наиболее оптимальное значение Rf в системе растворителей н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:1). На линию старта длиной 15 см наносили 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 мкл раствора СО байкалина. Пробы наносили при помощи микрошприца МШ-10. Пластинки помещали в камеру для хроматографирования объемом 2000 см3, насыщенную парами растворителя. После подъема растворителя на необходимый уровень пластинки вынимали, высушивали в вытяжном шкафу при комнатной температуре до удаления паров растворителя. Длина пробега растворителя около 8 см. Детектирование проводили в УФ свете и 5% NaOH, пластинки сканировали при помощи планшетного сканера «HP Scanjet 3670» (разрешение 100 dpi) и далее осуществляли ее цифровую обработку с помощью компьютерной программы «Видеоденситометр Sorbfil» (г. Краснодар). Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки (внешнего стандарта), по градуировочному графику зависимости «масса вещества - площадь пика» (линейная аппроксимация). Статистическая обработка результатов проводилась в соответствии с ОФС «Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний» [6]. На цифровой хроматограмме СО байкалина находится два пика с Rf 0,26 и 0,43 одинаковой окраски, что свидетельствует о неоднородности стандартного образца (рис. 1). Рисунок 1 - Хроматограмма СО байкалина, полученная методом ТСХ Рисунок 2 - Хроматограмма СО байкалина, полученная методом ГХ/МС Методом внутренней нормализации определено, что содержание вещества с Rf 0,26 составило 39,9%, а с Rf 0,43 - 60,1%. Полученные нами данные соответствуют результатам, полученным методом ГХ/МС (рис. 2). Исследования проводили по данным пика с Rf 0,43. Согласно рекомендации ГФ XII и международных стандартов, любая аналитическая методика должна быть подвергнута валидации, т.е. экспериментальному подтверждению ее пригодности к практическому использованию и получению достоверной информации об объекте анлиза. Валидацию методики определения байкалина проводили по следующим характеристикам: предел обнаружения (ПО), предел количественного определения, линейность, правильность. Предел обнаружения (ПО) рассчитывали по формуле: ПО = 3,3×S/b, где: S - стандартное отклонение сигнала; b - угловой коэффициент градуировочного графика. ПО = 0,197мкг. Предел количественного определения (ПКО) рассчитывали по формуле: ПКО = 10 . S/b, где: S - стандартное отклонение сигнала; b - угловой коэффициент градуировочного графика. ПКО = 0,6 мкг. Линейность методики определяли экспериментально измерением аналитических сигналов для 5-и проб с разными концентрациями байкалина. При изучении зависимости площадей пиков от концентрации байкалина был получен следующий градуировочный график (рис. 3). Рисунок 3 - Градуировочный график СО байкалина Уравнение регрессии и коэффициент корреляции были рассчитаны в электронных таблицах Microsoft Excel. Методом наименьших квадратов определяли значимость свободного члена линейной зависимости (а) и углового коэффициента (b). Установлено, что зависимость площадей пиков от содержания байкалина в аналитической области методики (от 2 до 6 мкг в вводимой пробе) является линейной. Коэффициент корреляции r = 0,993. Уравнение регрессии имеет вид S=2,73.103 m. Правильность методики определяли методом «введено-найдено». По уравнению градуировочного графика рассчитывали содержание байкалина на 5-и уровнях концентраций СО и определяли метрологические характеристики (табл. 1) Таблица 1 - Оценка правильности определения байкалина Уровень Взято, мкг Найдено, мкг Открываемость, % Метрологические характеристики 1 2,0 2,13 105 Хср = 100,2 SD = 1,2 ΔX=2,76 RSD = 3,85% Е% =2,76% 1 2,0 1,85 93 2 3,0 3.06 102 2 3,0 2,95 98 3 4,0 3,90 97 3 4,0 4,19 105 4 5,0 4,88 98 4 5,0 5,15 103 5 6,0 5,95 99 5 6,0 6,13 102 Данной методикой было проведено обнаружение байкалина в спиртовом комплексном экстракте шлемника байкальского корней, синюхи голубой и пустырника травы. Ранее было доказано, что доминантным веществом комплекса является байкалин. На хроматограмме экстракта обнаружено 7 пятен, причем 2 из них по окраске и величине Rf соответствуют СО байкалина. Коэффициенты разделения α = 1,17 (пятно с Rf 0,43) и 1,12 (пятно с Rf 0,26). Результаты исследований свидетельствуют, что методика имеет достаточно высокую чувствительность и эффективность. Методика количественного определения отвечает необходимым требованиям по показателям линейность и правильность. Данную методику можно использовать для идентификации и количественного определения байкалина в растительном сырье.

About the authors

V. E Kim

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - a branch of Volgograd State Medical University, Pyatigorsk

T. D Mezenova

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - a branch of Volgograd State Medical University, Pyatigorsk

D. A Konovalov

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - a branch of Volgograd State Medical University, Pyatigorsk

Email: konovalov_da@pochta.ru

References

Supplementary files