EXPERIMENTAL STUDY OF GASTROPROTECTIVE ACTIVITY OF TRANSDERMAL ETHYLMETHYLHYDROXYPYRIDINE SUCCINATE

Full Text

Актуальной проблемой во всем мире является развитие гастропатий, индуцированных не только приемом этанола, нестероидных противовоспалительных средств (НПВС), но и инициированных стрессом. Предложено большое количество теорий ульцерогенеза, наиболее признанными из них являются сосудистая, гормональная, неврогенная теории [2]. Ведущее значение в ульцерогенезе принадлежит частным механизмам, из которых заслуживает особого внимания механизм развития эрозивных поражений в результате активации процессов перекисного окисления липидов в плазме крови или ткани слизистой оболочки желудка. В последние годы в клинической медицине возрастает интерес к разработке эффективных мер защиты от разрушающего воздействия активных форм кислорода и перекисных радикалов молекул биосубстрата, среди которых первое место принадлежит внедрению в медицинскую практику антиоксидантов, включение в комплексную терапию которых будет способствовать эффективной профилактике и терапии многочисленных заболеваний [5]. В настоящее время в гастроэнтерологии применяются несколько лекарственных препаратов антиоксидантов, синтезирован ряд новых оригинальных соединений с антигипоксантными и антиоксидантными свойствами, применяемые чаще всего перорально, не обладающие пролонгированным характером высвобождения. Гастропротекторная и стресспротекторная активность субстанции этилметилгидроксипиридина сукцината при ее пероральном приеме в определенном спектре доз доказана на различных моделях ульцерогенеза [1]. Авторами сконструирована ТДТС матричного типа с этилметилгидроксипиридина сукцинатом согласно патента и доказана церебропротекторная активность мексидола в составе системы на модели черепно-мозговой травмы в дозах 30-50 мг/кг [3, 4, 7]. Изучение гастропротекторных свойств этилметилгидроксипиридина сукцината при его трансдермальном введении с использованием классической модели стресса позволит не только расширить знания в области патогенеза, но и выявить возможность использования трансдермального способа введения с целью доставки в организм этилметилгидроксипиридина сукцината. Целью работы явилось изучение гастропротекторных свойств этилметилгидроксипиридина сукцината (мексидола) при его трансдермальном введении в форме ТДТС матричного типа на модели 18-часовой иммобилизации предварительно голодавших сутки животных. Доклинические фармакологические исследования проводили с использованием экспериментальных животных - белых лабораторных крыс-самцов массой 220-240 г. Предварительно животные были разделены на 16 групп (n = 7): интактную (И), контрольные группы КТЭ 1-6, опытные ЭПТ 1-7. Также выделяли группу сравнения ЭВ и соответствующую ей контрольную группу животных, которые получали внутрижелудочно воду очищенную в том же объеме и с той же кратностью. Животных содержали в условиях вивария на обычной лабораторной диете. Все экспериментальные процедуры выполнялись в полном соответствии с российскими и международными этическими нормами научных исследований [6]. При изучении гастропротекторной активности опытным группам животных (ЭПТ 1-7) накладывали ТДТС с мексидолом с определенной площадью на межлопаточную область спины за 5 дней до иммобилизации и в момент воздействия стресса с содержанием в 1 см2 системы 2 мг лекарственного вещества (ЛВ) в дозах 5, 10, 15, 20, 40, 75 и в дозе 150 мг/кг с содержанием в 1 см2 4 мг ЛВ. Дозы мексидола выбраны исходя из литературных данных о применении 5% раствора мексидола для инъекций, а также с учетом степени высвобождения ЛВ из ТДТС по результатам биофармацевтического метода исследования (56,8%) [3]. Сверху ТДТС фиксировали полоской пластыря гипоаллергенного. ТДТС заменяли с периодичностью 1 раз в 3 дня. Предварительно перед наложением ТДТС пинцетом очищали от шерсти участок кожи межлопаточной области крысы, протирали его 20% этанолом и насухо вытирали. Для контрольных групп конструировали серию ТДТС без лекарственного вещества, содержащую только компоненты трансдермальной матрицы. Контрольным группам животных (КТЭ 1-7) аналогичным образом накладывали ТДТС с той же площадью, что и в соответствующих опытных группах. После 18-часовой иммобилизации перед декапитацией животных ТДТС с поверхности кожи удаляли. Животным группы сравнения (ЭВ) мексидол вводили в дозе 20 мг/кг/сут внутрижелудочно через зонд, предварительно растворив субстанцию препарата в 2мл воды очищенной. Раствор мексидола вводили перорально в течение 5 дней до воздействия стресса, осуществляя последнее введение за 30 минут до иммобилизации. Для сравнения выбрана терапевтически эффективная доза мексидола с учетом литературных данных [1, 2]. Иммобилизацию проводили путем фиксации ремнями за конечности животных на платформах, расположенных под углом 45° в положении на спине. По истечении 18 часов иммобилизации животных повторно взвешивали, фиксируя степень снижения массы тела по сравнению с исходным уровнем и декапитировали под легким эфирным наркозом. Из декапитированного тела крысы извлекали желудок, разрезали его по малой кривизне и промывали изотоническим раствором натрия хлорида. Состояние слизистой желудка оценивали физическими и гистологическими методами. На слизистой оболочке желудка (СОЖ) с помощью увеличительного стекла регистрировали количество эрозий и геморрагий в расчете на одно животное, общую площадь поражения слизистой в мм². Фрагменты биоптатов желудков крыс фиксировали в 10% растворе нейтрализованного формалина и подвергали стандартной гистологической проводке. Гистологические исследования гастробиоптатов выполнены на базе Смоленского областного института патологии при СГМА. Гомогенат слизистой оболочки желудка готовили в день проведения эксперимента из расчета 500 мг ткани на 5 мл фосфатного буфера. После центрифугирования в супернатанте гомогената ткани желудка определяли активность перекисного окисления липидов (ПОЛ), исследуя основные параметры биохемилюминесценции на отечественном биохемилюминометре 3606М (Россия). В качестве оценочных показателей использовали величину светосуммы (S), максимальную интенсивность хемилюминесцентного свечения (Фмакс.), значение соотношения Фмакс./S, тангенса угла подъема быстрой вспышки (Ltg), тангенса угла спада быстрой вспышки (Rtg), времени достижения максимума (Тмакс.) [3]. После декапитации и извлечения органов на аналитических весах (ВЛР-200г-М 2 класса) определяли массу тимуса, селезенки, надпочечников, вычисляли коэффициент по формуле: коэффициент массы = = масса органа / масса тела * 1000. Результаты экспериментов подвергали статистической обработке с помощью пакета StatGraphics v 5.0. Результаты экспериментов свидетельствовали о том, что острый иммобилизационный стресс у животных контрольной группы в 100% случаев сопровождался не только возникновением эрозий клиновидно-щелевидной формы, но и гипертрофией надпочечников, инволюцией тимуса, селезенки, активацией процессов липидной пероксидации в супернатанте гомогената ткани желудка. Это проявлялось в достоверном увеличении значений максимальной интенсивности хемилюминесцентного свечения в сравнении с интактом (р < 0,05), величины светосуммы хемилюминесценции (р < 0,00001), тангенса угла подъема быстрой вспышки (р < 0,00001), а также в снижении значений тангенса угла спада быстрой вспышки (р < 0,05) и времени достижения максимума (р < 0,05) в сравнении с интактной группой. Гистологическое исследование гастробиоптатов контрольных групп животных подтвердило наличие острых эрозий и геморрагий в СОЖ (рис. 1). Применение ТДТС с мексидолом, а также внутрижелудочное введение субстанции ЛВ с целью профилактики стресс-индуцированного ульцерогенеза изменяло картину и степень поражения СОЖ. Крыса ♂, вес 224,8 г. Увеличение ×40 (объектив). Эрозия клиновидной формы. Слущивание эпителия валиков. Рисунок 1 - СОЖ крыс контрольной группы Крыса ♂, вес 224,6 г. Увеличение ×40 (объектив). Стаз в капиллярах. Лейкоцитарная инфильтрация вокруг сосудов, спазм сосудов. Рисунок 2 - СОЖ крыс на фоне коррекции этилметилгидроксипиридина сукцинатом в форме ТДТС в дозе 40 мг/кг Гистологическое исследование гастробиоптатов опытных групп на фоне применения ТДТС с антиоксидантом свидетельствовало об отсутствии эрозивных дефектов СОЖ. Наблюдали стазы в капиллярах, слущивание эпителия валиков, имеющее вторичный характер и, по-видимому, связанное с дисциркуляторным повреждением в подслизистом слое (рис. 2,4). Достоверных различий в гистологической картине гастробиоптатов на фоне применения ТДТС с этилметилгидроксипиридина сукцинатом в дозах 20-75мг/кг, а также группы сравнения выявлено не было (рис. 2,3,4). Крыса ♂, вес 223,8,0 г. Увеличение ×360. Лейкоцитарная инфильтрация Рисунок 3- СОЖ крыс группы сравнения на фоне фармакологической коррекции этилметилгидроксипиридина сукцинатом в дозе 20 мг/кг при внутрижелудочном введении Крыса ♂, вес 231,3 г. Увеличение ×20. Полнокровные сосуды подслизистого слоя. Лейкоцитарная инфильтрация вокруг сосудов Рисунок 4 - СОЖ крыс на фоне фармакологической коррекции этилметилгидроксипиридина сукцинатом в форме ТДТС в дозе 75 мг/кг На фоне стрессорного повреждения трансдермальный мексидол оказывал защитное действие: пятидневное лечебно-профилактическое трансдермальное введение мексидола в дозах 20-75 мг/кг способствовало достоверному уменьшению не только количества дефектов слизистой относительно контрольных значений (p < 0,001), но и общей площади поражения (табл. 1) относительно значений группы сравнения (p < 0,05). Таблица 1 - Результаты исследования количества дефектов СОЖ крыс и общей площади поражения при трансдермальном и внутрижелудочном введении этилметилгидроксипиридина сукцината, (М+m) Группа Количество дефектов СОЖ на 1 животное, шт. Общая площадь поражения, кв. мм. Интактная группа - - КТЭ-1 4,29±0,70 3,66±0,72 ЭПТ-1 5мг/кг 3,29±0,45 p<0,05; p1<0,01 0,75±0,24 p<0,0001; p1<0,0001 КТЭ-2 5,63±0,76 3,84±0,61 ЭПТ-2 10мг/кг 3,75±1,16 p<0,01; p1<0,05 1,20±0,47 p<0,001; p1<0,01 КТЭ-3 4,38±0,89 4,07±0,83 ЭПТ-3 15мг/кг 3,34±0,83 p<0,05; p1<0,05 1,10±0,16 p<0,00001; p1<0,00001 КТЭ-4 5,14±0,83 6,00±1,17 ЭПТ-4 20мг/кг 2,00±1,19 p<0,001 0,38±0,22 p<0,00001; p1<0,00001 КТЭ-5 5,00±0,63 5,14±0,75 ЭПТ-5 40мг/кг 2,50±0,77 p<0,0001 0,88±0,15 p<0,00001; p1<0,00001 КТЭ 6-7 5,14±0,83 1,95±0,44 ЭПТ-6 75мг/кг 1,62±0,62 p<0,0001 0,24±0,09 p<0,00001; p1<0,00001 ЭПТ-7 150мг/кг 0,88±0,54 p<0,00001; p1<0,05 0,06±0,04 p<0,00001; p1<0,00001 ЭВ 20мг/кг 2,00±0,76 p<0,0001 2,07±0,23 p<0,00001 К 5,83±1,39 6,80±0,83 Примечание: в табл. 1,2,3 - p<0,05- достоверные отличия по отношению к контрольной группе; p1<0,05 - достоверные отличия по отношению к группе сравнения. Этилметилгидроксипиридина сукцинат в форме ТДТС в вышеуказанном спектре доз способствовал достоверному снижению активности реакций липидной пероксидации в супернатанте гомогената ткани желудка и повышению антиоксидантного статуса организма относительно значений контрольных групп животных (р < 0,001), корректируя патологически сниженные или завышенные параметры биоиндуцированной хемилюминесценции, не уступая по эффективности группе сравнения и в некоторых случаях даже превосходя ее (p1 < 0,001). Курсовое трансдермальное введение этилметилгидроксипиридина сукцината в дозах 40-150 мг/кг способствовало достоверному уменьшению степени гипертрофии надпочечников, инволюции тимуса и селезенки (p < 0,05), при этом стресс-протекторный эффект трансдермального этилметилгидроксипиридина сукцината был сопоставим с эффектом группы сравнения, а в дозах 75-150 мг/кг даже превышал его (табл. 2, 3). Таблица 2 - Результаты исследования влияния иммобилизационного стресса на массу надпочечников крыс при применении ТДТС с этилметилгидроксипридина сукцинатом, (М±m) Группа животных К массы надпочечников % к интакту Интактная группа 0,0825±0,009 100% КТЭ-1 0,101±0,009 122,42% ЭПТ-1 5мг/кг 0,094±0,009 p<0,05 113,94% КТЭ-2 0,090±0,002 109,58% ЭПТ-2 10мг/кг 0,094±0,002 p<0,05 113,94% КТЭ-3 0,109±0,008 132,12% ЭПТ-3 15мг/кг 0,100±0,007 p<0,01 121,21% КТЭ-4 0,099±0,009 120,0% ЭПТ-4 20мг/кг 0,094±0,007 p<0,05 113,94% КТЭ-5 0,119±0,009 144,24% ЭПТ-5 40мг/кг 0,092±0,005 p<0,01; p1<0,001 111,52% КТЭ 6-7 0,102±0,008 123,64% ЭПТ-6 75мг/кг 0,088±0,004 p1<0,01; p2<0,01 106,67% ЭПТ-7 150мг/кг 0,096±0,004 p<0,01 116,36% ЭВ 20мг/кг 0,093±0,003 p<0,05; p1<0,001 112,73% К 0,104±0,004 126,06% Примечание: p2<0,05 - достоверные отличия по отношению к группе сравнения; p3<0,05 - достоверные отличия между опытными группами. Таблица 3 - Результаты исследования влияния иммобилизационного стресса на массу тимуса и селезенки крыс при применении этилметилгидроксипиридина сукцината в форме ТДТС, (М±m) Группа животных Тимус К массы тимуса Тимус % к интакту Селезенка К массы селезенки Селезенка % к интакту 1 2 3 4 5 Интактная группа 1,023±0,01 100% 3,35±0,26 100% КТЭ-1 0,65 ± 0,056 63,54% 2,11±0,12 62,98% ЭПТ-1 5мг/кг 0,66±0,07 p<0,0001; p2<0,05 64,52% 2,12±0,11 p<0,00001; p2<0,00001 63,28% КТЭ-2 0,57±0,05 55,72% 2,01±0,09 60,0% ЭПТ-2 10мг/кг 0,65± 0,07 p <0,00001; p2<0,05 63,54% 2,36±0,19 p <0,00001; p1<0,01; p2<0,001 70,45% КТЭ-3 0,61± 0,05 59,63% 1,92±0,11 57,31% ЭПТ-3 15мг/кг 0,67 ± 0,06 p <0,00001 65,49% 2,25±0,17 p <0,00001; p1<0,01; p2<0,0001 67,16% КТЭ-4 0,59± 0,03 57,67% 1,73±0,11 51,64% Продолжение таблицы 3 1 2 3 4 5 ЭПТ-4 20мг/кг 0,61 ± 0,04 p <0,00001; p2<0,01 59,63% 2,50±0,24 p <0,0001; p1<0,0001; p2<0,01 74,63% КТЭ-5 0,62±0,02 60,61% 1,72±0,09 51,34% ЭПТ-5 40мг/кг 0,71± 0,02 p <0,00001; p1<0,0001 69,40% 2,54±0,24 p <0,001; p1<0,00001 p2<0,01 75,82% КТЭ 6-7 0,69±0,04 67,45% 2,46±0,16 73,43% ЭПТ-6 75мг/кг 0,79 ± 0,05 p<0,00001; p1<0,001 77,22% 2,77±0,23 p <0,01; p1<0,05 82,69% ЭПТ-7 150мг/кг 1,05±0,04 p1<0,00001; p2<0,001 102,64% 3,79±0,11 p <0,01; p1<0,00001; p2<0,00001 113,13% ЭВ 20мг/кг 0,79±0,11 p <0,001; p1<0,01 77,22% 2,94±0,17 p <0,01; p1<0,0001 87,76% К 0,58±0,10 56,70% 1,87±0,31 55,82% Примечание: p<0,05- достоверные отличия по отношению к интактной группе; p1<0,05 - достоверные отличия по отношению к контрольной группе; p2<0,05 - достоверные отличия по отношению к группе сравнения; p3<0,05 - достоверные отличия между опытными группами. Результаты экспериментов, представленные в таблицах 1, 2, 3 и на рисунках 2, 4, свидетельствуют о том, что трансдермальный этилметилгидроксипиридина сукцинат при применении в течение 5 дней до 18-часовой иммобилизации и в момент воздействия стресса (лечебно-профилактическая схема) в дозах 20-75 мг/кг проявляет высокую гастропротекторную активность, а в дозах 40-150 мг/кг стресс-протекторную активность, однако в дозе 150 мг/кг этилметилгидроксипиридина сукцинат инициирует гемолиз эритроцитов после его 14-дневного трансдермального введения, что было выявлено в ходе исследования субхронической токсичности. Таким образом, спектр терапевтических доз этилметилгидроксипиридина сукцината в форме ТДТС на модели 18-часовой иммобилизации составил 20-75 мг/кг. Выводы 1. Пятидневное лечебно-профилактическое трансдермальное введение этилметилгидроксипиридина сукцината в дозах 20-75 мг/кг способствует достоверному уменьшению количества дефектов слизистой относительно контрольных значений, общей площади поражения относительно значений группы сравнения с внутрижелудочным введением препарата. 2. Этилметилгидроксипиридина сукцинат в форме ТДТС в дозах 20-75 мг/кг способствует достоверному снижению активности реакций липидной пероксидации в ткани желудка и повышению антиоксидантного статуса организма относительно значений контрольных групп животных. 3. Этилметилгидроксипиридина сукцинат в форме ТДТС в дозах 40-150 мг/кг способствует достоверному уменьшению степени гипертрофии надпочечников, инволюции тимуса и селезенки относительно контрольной группы животных.

About the authors

Smolensk state medical university, Smolensk Losenkova

Email: losenkova-so@mail.ru

E. F Stepanova

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - a branch of Volgograd State Medical University, Pyatigorsk

Email: EFStepanova@yandex.ru

References

Supplementary files