WORKING OUT QUALITY STANDARDS OF MODEL COMPOSITION SAMPLES OF GRANULATED DOSAGE FORM WITH GLUTATHIONE RESTORED

Full Text

DOI: 10.19163/2307-9266-2019-7-1-13-19 УДК 543.544 РАЗРАБОТКА НОРМ КАЧЕСТВА ОБРАЗЦОВ МОДЕЛЬНОГО СОСТАВА ГРАНУЛИРОВАННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ С ГЛУТАТИОНОМ ВОССТАНОВЛЕННЫМ К.А. Алексеева1, Д.И. Писарев1, А.Ю. Малютина1, Е.Т. Жилякова1, З.Е. Цветкова1, Ю.А. Полковникова2 ФГАОУ ВО НИУ «Белгородский государственный университет» Минобрнауки России 308015, Россия, г. Белгород, ул. Победы, 85 2 ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» Минобрнауки России 394018, Россия, г. Воронеж, Университетская пл., 1 E-mail: pisarev@bsu.edu.ru 1 Поступила в редакцию: 14.01.2019 Принята к печати: 25.02.2019 Биологически активные серосодержащие соединения (БАСС) проявляют ярко выраженные антиоксидантные свойства. Особое положение из числа данных соединений занимает глутатион восстановленный (GSH). Он представляет собой ключевое звено 3-х антиоксидантных систем организма из существующих четырех. Исходя из вышесказанного, нами была предложена лекарственная форма на основе GSH, обладающая антиоксидантными свойствами. Целью данного исследования является разработка модельной гранулированной лекарственной формы на основе GSH и методики ее анализа с помощью предколоночной дериватизации орто-фталевым альдегидом. Материалы и методы. В качестве объекта исследования использовали GSH и гранулированную лекарственную форму на основе GSH, полученную методом влажного гранулирования. Оценку количественного содержания GSH в полученных гранулах, проводился с помощью предколоночной дериватизации методом обращено-фазной высокоэффективной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). В качестве дериватизурующего агента использован орто-фталевый альдегид. Для обнаружения образовавшегося деривата был применен диодно-матричный детектор. Результаты. В ходе работы была создана модельная лекарственная форма – гранулы на основе GSH. Исходя из рекомендаций по дозировке препарата подобрана концентрация действующего вещества. В качестве вспомогательного компонента была выбрана лактоза. Изучены физические и технологические характеристики модельного образца гранул с GSH и лактозой в качестве наполнителя. Разработана и отвалидирована методика количественного определения GSH в гранулах с использованием предколоночной дериватизации орто-фталевым альдегидом методом ВЭЖХ. Заключение. Разработанная гранулированная лекарственная форма по анализируемым показателям соответствует требованиям, приведенным в ОФС «Гранулы». При помощи валидационной оценки установлено, что разработанная методика количественного определения GSH в гранулах является правильной, прецизионной и специфичной. Ключевые слова: глутатион восстановленный, орто-фталевый альдегид, гранулы, обращённо-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография, дериватизация, валидация Для цитирования: К.А. Алексеева, Д.И. Писарев, А.Ю. Малютина, Е.Т. Жилякова, З.Е. Цветкова, Ю.А. Полковникова. Разработка норм качества образцов модельного состава гранулированной лекарственной формы с глутатионом восстановленным. Фармация и фармакология. 2019;7(1):13-19. DOI:10.19163/2307-9266-2019-7-1-13-19 © К.А. Алексеева, Д.И. Писарев, А.Ю. Малютина, Е.Т. Жилякова, З.Е. Цветкова, Ю.А. Полковникова, 2019 For citation: K.A. Alekseeva, D.I. Pisarev, A.Yu. Malyutina, E.T. Zhilyakova, Z.E. Tsvetkova, Yu.A. Polkovnikovа. Working out quality standards of model composition samples of granulated dosage form with glutathione restored. pharmacy & Pharmacology. 2019;7(1): 13-19. DOI:10.19163/2307-9266-2019-7-1-13-19 Volume VII, Issue 1, 2019 13 оригинальная статья ISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241 WORKING OUT QUALITY STANDARDS OF MODEL COMPOSITION SAMPLES OF GRANULATED DOSAGE FORM WITH GLUTATHIONE RESTORED K.A. Alekseeva1, D.I. Pisarev1, A.Yu. Malyutina1, E.T. Zhilyakova1, Z.E. Tsvetkova1, Yu.A. Polkovnikovа2 Belgorod State National Research University 85, Pobeda Str., Belgorod, Russia, 308015 2 Voronezh State University 1, Universitetskaya Sq., Voronezh, Russia, 394006 1 E-mail: pisarev@bsu.edu.ru Received: 14.01.2019 Accepted for publication: 25.02.2019 Biologically active sulfur-containing compounds (BASC) exhibit pronounced antioxidant properties. Glutathione reduced (GSH) occupies a particular position among these compounds. It represents a key link in the 3 antioxidant systems of the body from the existing four. Based on the foregoing, a GSH-based dosage form with antioxidant properties was proposed. The aim of this study is to work out a model granulated dosage form based on GSH and methods of its analysis by means of precolumn derivatization with ortho-phthalic aldehyde. Materials and methods. GSH and granulated dosage form based on GSH obtained by wet granulation were used as the object of study. Quantitative evaluation of GSH content in the obtained granules was carried out using pre-column derivatization using the method of reversed-phase high-performance chromatography (RP HPLC). Ortho-phthalic aldehyde was used as a derivatizing agent. A diode-array detector was used to detect the resulting derivative. Ortho-phthalic aldehyde was used as a derivatizing agent. A diode-matrix detector was used to find out the resulting derivative. Results. In the course of the work, a model dosage form was created – granules based on GSH. By reference to the recommendations on the dosage of the drug, the concentration of the active substance was selected. Lactose was chosen as an auxiliary component. Physical and technological characteristics of a model sample of granules with GSH and lactose as a filler were studied. A method of quantitative determination of GSH in granules using pre-column derivatization with orthophthalic aldehyde was developed and validated by HPLC. The method of quantitative determination of GSH in granules with the use of pre-column derivatization by ortho-phthalic aldehyde by HPLC was developed and validated. Conclusion. The developed granulated dosage form meets the requirements given in the EF “Granules” according to the analyzed indicators. Using the validation evaluation it was established, that the developed method for the quantitative determination of GSH in granules is correct, precise and specific. Keywords: reduced glutathione, ortho-phthalic aldehyde, granules, reverse phase high performance liquid chromatography, derivatization, validation ВВЕДЕНИЕ Глутатион восстановленный (GSH) ˗ трипептид, содержащий в своем составе аминокислотные остатки L-глутаминовой кислоты, глицина и L-цистеина. GSH является одним из неферментативных компонентов, принимающих участие в антиоксидантной защите живых организмов. Он выступает действенным антирадикальным средством и играет ключевую роль в жизненном цикле клеток, обусловливая их защиту от свободных радикалов, гидропероксидов и ксенобиотиков [1, 2]. Статус GSH является индикатором функциональности и жизнеспособности клеток [3, 4]. Истощение или изменение его уровня внутри клетки провоцирует ряд таких заболеваний, как онкологические, нейродегенеративные, сердечно-сосудистые [5, 6]. Исследования in vitro и in vivo подтверждают, что дефицит GSH может послужить причиной гибели клеток и повреждений митохондрий вследствие повышения количества токсичных форм кислоро14 да и роста численности свободных радикалов [7]. GSH способен предупреждать разрушение клеток посредством конъюгации с токсичными веществами и их метаболитами. Глутатионовая конъюгация занимает одно из центральных мест в механизмах биотрансформации ряда ксенобиотиков [8–10]. На сегодняшний день известно более сорока типов химических соединений, которые вступают в реакции с GSH. Сопрягающим фактором подобного рода реакций является наличие электрофильного центра, способного реагировать с SH-группой GSH [11]. Следовательно, система обезвреживания ксенобиотиков с участием GSH имеет ключевую роль в формировании резистентности организма к разным воздействиям и представляет собой один из самых важных защитных механизмов клетки. При этом конъюгаты GSH с ксенобиотиками менее реакционноспособны и более гидрофильны, чем исходные вещества, поэтому менее токсичны и быстрее элиминируют из организма [12, 13]. GSH также Том 7, Выпуск 1, 2019 DOI: 10.19163/2307-9266-2019-7-1-13-19 способен предотвращать внедрение липофильных токсикантов в липидный бислой мембран [14]. GSH обладает мембраностабилизирующим действием на гепатоциты, увеличивает активность ферментов и способствует детоксикации и восстановительной активности печени посредством обезвреживания свободных радикалов [15]. Учитывая спектр фармакологической активности глутатиона, нами была предложена лекарственная форма с GSH, обладающая выраженными антиоксидантными свойствами. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве объекта исследования использовали глутатион восстановленный (CAS №70-18-8, EC № 2007254, Applichem, Германия) и вспомогательное вещество – лактозу. Выбор данного компонента объясняется возможностью его применения в качестве наполнителя, корригента и агента, регулирующего некоторые технологические показатели гранул (прочности, распадаемости и т.д.). Преимущества лактозы как вспомогательного вещества [16]: – инертный материал, высокая чистота, нейтральная окраска; – влагоустойчивость; – физическая и химическая стабильность; – хорошо подвергается измельчению и просеиванию; – высокая степень кристаллизации, низкая степень аморфности. Угол смачивания GSH водой меньше 90о и составляет 45±5°, из чего сделан вывод о том, что GSH является гидрофильной субстанцией, поэтому в качестве увлажнителя в модельном образце гранул использовалась вода очищенная. Для получения модельного образца гранул применяли метод влажного гранулирования. Формирование гранул происходит в результате продавливания увлажненной массы через перфорированное сито. Технологические характеристики полученных гранул определяли с использованием изложенных ниже методик. Степень сыпучести гранул устанавливали по методике ГФ XIV издания (ОФС «Степень сыпучести порошков»), используя вибрационное устройство – ВП-12А (ЖЗТО). Размеры полученных гранул определяли с помощью ситового анализа в соответствии с ГФ XIV (ОФС «Ситовой анализ»). Испытание «распадаемости» осуществляли на тестере распадаемости «Качающаяся корзинка» в соответствии с ГФ XIV (ОФС «Гранулы»). Результаты теста «Растворение» отмечали на тестере растворения «Мешалка лопастная» в соответствии с ОФС.1.4.2.0014.15. Volume VII, Issue 1, 2019 Количественное определение GSH в гранулированной лекарственной форме проводили методом обращенно-фазной высокоэффективной хроматографии с помощью предколоночной дериватизации данного терапевтического агента орто-фталевым альдегидом [17]. Анализ проводили на хроматографе «Agilent Technologies 1200 Infinity» c автоматическим пробоотборником, вакуумным микродозатором, градиентным насосом и термостатом. Условия градиентного хроматографирования: подвижная фаза (А) – 1% водный раствор кислоты муравьиной, (Б) – спирт этиловый 95%; колонка: Ascentis express C18 2,7 дм × 100 мм × 4,6 мм; скорость подвижной фазы: 0,5 мл/мин; температура колонки: +35±0,01оС; объем вводимой пробы: 1 μл. У GSH отсутствуют хромофоры, пригодные для его анализа методами УФ-спектроскопии и ВЭЖХ с диодно-матричным детектированием. В связи с этим нами предложен анализ GSH методом ВЭЖХ путем его химической трансформации дериватизирующим агентом – орто-фталевым альдегидом. В результате реакции полученный дериват GSH и орто-фталевого альдегида приобретает хромофорную метку, которую и фиксируют в ходе хроматографического анализа с помощью диодно-матричного детектирования. Методика дериватизации гранул на основе глутатиона 1 мл 0,1%-ного раствора гранул глутатиона в 0,05 М водном растворе натрия тетрабората помещали в склянку для анализа вместимостью 10 мл, добавляли 1 мл 0,35%-ного раствора орто-фталевого альдегида в этаноле, тщательно взбалтывали и сразу хроматографировали. Приготовление модельных испытуемых растворов при валидационной оценки методики Характеристики правильности и прецизионности исследовали на модельных образцах препарата с концентрациями глутатиона, которые соответствовали 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115% и 120% их содержания по отношению к номинальному значению. Для приготовления модельных образцов препарата использовали мерные колбы вместимостью 25 мл. Навески брали непосредственно из компонентов препарата. Массы навесок и концентрации полученных растворов глутатиона приведены в таблице 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ На основании полученных экспериментальных данных была создана модельная лекарственная форма – гранулы на основе глутатиона. Концентрация действующих веществ выбрана исходя из рекомендаций по дозировке препарата (0,05–0,5 г). Состав гра15 оригинальная статья ISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241 нул на однодозовый пакет фасовкой 3,0 г: глутатион – 0,1 г, лактоза – 2,9 г. На следующем этапе работы были определены органолептические, физические и технологические показатели гранул на основе глутатиона. Результаты исследования представлены в таблице 1. Таблица 1. Фармацевтико-технологические характеристики гранулированной модельной лекарственной формы на основе GSH Исследуемый показатель Методика определения Значения, полученные экспериментальным путем Размер гранул ОФС.1.1.0015.15 1,0–1,2 мм Форма гранул ОФС.1.2.1.0009.15 Анизодиаметрическая (удлиненная) Насыпная плотность ОФС.1.4.2.0016.15 460,10 ±1,31кг/м3 (Легкие) Сыпучесть ОФС.1.4.2.0016.15 7,14 ±0,25 г/с (Хорошая) Распадаемость Прочность Высвобождение глутатиона ОФС.1.4.2.0013.15 ОФС.1.4.2.0004.15 Растворимость гранул в воде Потеря в массе при высушивании Однородность дозирования Содержание глутатиона, г ОФС.1.4.2.0014.15 4±2 минут 98,5±0,5% 99,9±0,50% (в течение 15 минут) ОФС.1.2.1.0005.15 Крупная фракция: >1,2 мм Средняя фракция: 1,2 мм Мелкая фракция: 1,0 мм Удлиненная: >3:1 Пластинчатая: 3:1 Равноосная: 1:1 Весьма тяжелые: >2000 кг/м3 Тяжелые: 1100–2000 кг/м3 Средние: 600–1100 кг/м3 Легкие: < 600 кг/м3 Отличная: 8,6–12,0 г/с Хорошая: 6,6–8,5 г/с Удовлетворительная: 3,0–6.5 г/с Допустимая: 2,0–3,0 г/с Плохая: 1,0–2,0 г/с Очень плохая: <1,0 г/с До 15 минут Не менее 97% 75% (в течение 45 минут) Очень легко растворимы: до 1 мл/г; Легко растворимы: 1-10 мл/г; Растворимы: 10-30 мл/г; Умеренно растворимы: 30-100 мл/г; Мало растворимы:100-1000 мл/г; Очень мало растворимы: 1000-10000 мл/г Практически не растворимы: более 10000 мл/г ОФС.1.2.1.0010.15 1,5±1% ОФС.1.4.2.0008.15 Выполняется ОФ ВЭЖХ 100,0±0,39% 100,09±0,39% Согласно данным таблицы 1 гранулы на основе глутатиона представляют собой удлиненные частицы размером 1,0–1,2 мм, относятся к легким крупинкам и обладают удовлетворительной сыпучестью. По показателям, приведенным в ОФС «Гранулы» (распадаемость, однородность дозирования, растворение), данная лекарственная форма соответствует требованиям. Гранулы на основе глутатиона можно использовать для наполнения капсул, а также в качестве самостоятельной лекарственной формы. Разработанные гранулы растворимы в холодной воде. Гранулы на основе глутатиона – лекарственная форма для приема внутрь с предварительным растворением в жидкости. С целью количественного определения GSH в гранулированной лекарственной форме разработана 16 Растворимы (1:30) Референтные значения методика предколоночной дериватизации орто-фталевым альдегидом. Дериватизация с указанным модификатором происходит обычно в течение 2–3 минут. Образующийся продукт легко определяется с помощью диодно-матричного или флуориметрического детектора. Длина волны образующегося деривата обычно составляет λ – 337 нм. Молярные соотношения орто-фталевого альдегида и глутатиона равны 3,5:1. При хроматографировании OPHA-деривата глутатиона наблюдается один пик со временем удерживания 18,066 мин. В УФ-спектре деривата обнаруживается несколько максимумов поглощения, наиболее специфичным из которых является λmax – 336 мн. При этом пик самого дериватизатора не виден, из-за иного максимума поглощения деривата (рисунок 1). Том 7, Выпуск 1, 2019 Research Article DOI: 10.19163/2307-9266-2019-7-1-13-19 Рисунок 1. УФ-спектр деривата орто-фталевого альдегида с GSH при длине волны 336 нм в гранулированной лекарственной форме Для подтверждения возможности использования предложенной нами методики идентификации и количественного определения глутатиона методом предколоночной дериватизации орто-фталевым альдегидом в гранулах проведена валидационная оценка по характеристикам: специфичность, линейность, сходимость (прецизионность) и правильность [18]. Валидационные параметры правильности, прецизионности и линейности изучены на растворах препара- та с концентрациями глутатиона в диапазоне 80–120% от номинального содержания глутатиона в гранулах. Это охватывает весь спектр концентрации и определяет минимальную допустимую концентрацию применения методики для количественного определения [19]. Критерии приемлемости рассчитывали для В=10%, следовательно, максимальная величина суммарной неопределенности результатов методики (ΔAs) на должна превышать значение В×0,32=3,2% [20]. Таблица 2. Массы навесок и концентрации глутатиона восстановленного в модельных образцах гранул Номер модельного образца Масса навесок препарата – гранул с глутатионом, г Содержание глутатиона восстановленного в навеске, г Концентрация глутатиона восстановленного по отношению к номинальной, % 1 0,6022 0,02000 80,41 2 0,6360 0,02120 85,42 3 0,6760 0,02250 90,85 4 0,7125 0,02370 95,07 5 0,7512 0,02500 100,02 6 0,7875 0,02620 105,20 7 0,8265 0,02755 110,03 8 0,8630 0,02876 114,96 9 0,9012 0,03000 119,92 Результаты хроматографирования, значения определенных концентраций глутатиона в модельных образцах и расчет метрологических характеристик методики представлены в таблице 3. Из информации, приведенной в таблице 3, следует, что методика количественного определения глутатиона не имеет статистически значимой систематической ошибки. Таким образом, валидационные Volume VII, Issue 1, 2019 испытания методики количественного определения глутатиона в гранулах методом предколоночной дериватизации орто-фталевым альдегидом показали соответствие валидационных параметров принятым количественным критериям по правильности, сходимости в диапазоне концентраций от 80% до 120% от номинального содержания глутатиона в гранулированной лекарственной форме. 17 оригинальнАЯ статья ISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241 Таблица 3 – Результаты валидации методики количественного определения глутатиона в модельных растворах гранул № раствора Взято глутатиона в % от концентрации раствора сравнения (Х, %) 1 80,41 2 85,42 3 90,85 4 95,07 5 100,02 6 105,20 7 110,03 8 114,96 9 119,92 Среднее, Z, % Относительное стандартное отклонение, Sz, % Найдено глутатиона в % к концентрации раствора сравнения (Y, %) 80,39 85,49 90,78 95,23 100,21 105,01 110,18 115,15 120,36 Найдено в % к взятому глутатиону Z = 100*(Y/X) 99,98 100,01 99,92 100,17 100,19 99,82 100,14 100,17 100,37 100,09 0,17% Относительный доверительный интервал, Δ, % = t (95%, 7)*Sz 0,39 Критическое значение для сходимости результатов, maxΔAs, %, при B±10% 3,2 Систематическая погрешность, δ = Zср-100 0,09 Критерий незначимости системной погрешности δ≤Δ/3 Общий вывод о методике выполняется корректна ЗАКЛЮЧЕНИЕ В ходе работы была создана модельная лекарственная форма – гранулы на основе глутатиона. Изучены физические и технологические характеристики модельного образца гранул с GSH и лактозой в качестве наполнителя. Разработана и валидирована методика количественного определения GSH в гра- нулах с использованием предколоночной дериватизации орто-фталевым альдегидом методом ВЭЖХ. Результаты валидационной оценки показали, что настоящая методика соответствует всем валидационным параметрам – является правильной, прецизионной, специфичной и линейной в аналитической области. БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 1. Winterbourn C.C. Superoxide as an intracellular radical sink // Free Radic. Biol. Med. – 1993. – Vol. 14, № 1. – P. 85–90. 2. High hepatic glutathione stores alleviate Fasinduced apoptosis in mice / S. Cazanave, A. Berson, D. Haouzi [et al.] // J Hepatol. – 2007. – Vol. 46, № 5. – P. 858–868. 3. Go Y.M., Jones D.P. Redox compartmentalization in eukaryotic cells / //Biochim Biophys Acta. – 2008. – Vol. 1780, № 11. – P. 1273–1290. DOI: 10.1016/j. bbagen.2008.01.011. 4. Glutathione binding to the Bcl-2 homology-3 domain groove: a molecular basis for Bcl-2 antioxidant function at mitochondria / A.K. Zimmermann, F.A. Loucks, E.K. Schroeder [et al.] // J. Biol. Chem. – 2007. – Vol. 282, № 40. – P. 29296–29304. DOI: 10.1074/jbc.M702853200. 5. Arnér E.S., Holmgren A. Physiological functions of thioredoxin and thioredoxin reductase // Eur J Biochem. – 2000. – Vol. 267, № 20. – P. 6102–6109. DOI: https://doi.org/10.1046/j.14321327.2000.01701.x 6. Iles K.E., Liu R.M. Mechanisms of glutamate cysteine ligase (GCL) induction by 4-hydroxynonenal // Free Radic. Biol Med. – 2004. – Vol. 38, № 5. – P. 547– 556. DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2004.11.012. 7. Corbucci G.G. The role of reduced glutathione during the course of acute haemolysis in glucose6-phosphate dehydrogenase deficient patients: clinical and pharmacodynamic aspects // Int J Clin Pharmacol Res. – 1990. – Vol. 10, №5. – P. 305–310. 8. Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А. Общие механизмы токсического действия. – Л.: Медицина, 1986. – 280 с. 9. Еропкин М.Ю., Еропкина Е.М. Культуры клеток как модельная система исследования токсичности и скрининга цитопротекторных препаратов. – СПб.: МОРСАР АВ, 2003. – 239 с. 10. Тиунов Л.А. Механизмы естественной детоксикации и антиоксидантной защиты // Вестник РАМН. – 1995. – №3. – С. 9–13. 11. Тиунов Л.А. Иванова В.А. Роль глутатиона в процессах детоксикации // Вестник АМН СССР. – 1988. – №1. – С. 62–69. 12. Harman D. Free-radical theory of aging: inversing the functional life span // Ann NY Acad Sci. – 2006. – Vol. 1067. – P. 10–21. DOI: 10.1196/annals.1354.003. 13. Lőrincz T., Szarka A. The determination of hepatic glutathione at tissue and subcellular level // 18 Том 7, Выпуск 1, 2019 DOI: 10.19163/2307-9266-2019-7-1-13-19 J Pharmacol Toxicol Methods. – 2017. – Vol. 88, pt. 1. – P. 32–39. DOI: 10.1016/j.vascn.2017.05.004. 14. Kanekal S., Kehrer J.P. Metabolism of cyclophosphamide by lipoxygenases // Drug Metab Dispos. – 1994. – Vol. 22, №1. – P. 74–78. 15. Traverso N., Ricciarelli R., Marengo B, et al. Role of glutathione in cancer progression and chemoresistance // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. – 2013. – Vol. 2013. – Article ID 972913. DOI: https://doi.org/10.1155/2013/972913. 16. Поляков Н.А., Дубинская В.А., Астраханова М.М., Быков В.А. Гидратация и термодинамические характеристики образцов альфа-лактозы, полученные с использованием новых технологий // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2011. – №8. – С. 7–11. 17. Lenton K.J., Therriault H., Wagner J.R. Analysis of glutathione and glutathione disulfide in whole cells and mitochondria by postcolumn derivatization high-performance liquid chromatography with ortho-phthalaldehyde // Anal Biochem. – 1999. – Vol. 274, № 1. – P. 125–130. DOI: 10.1006/ abio.1999.4258. 18. Общая фармакопейная статья ОФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитических методик». – ГФ XIV. – М., 2018. 19. Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств. Методические рекомендации. – М.: Спорт и Культура – 2000, 2007. – С. 6–92. 20. Общая фармакопейная статья ОФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента». – ГФ XIV. – М., 2018. Конфликт интересов Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Авторы Алексеева Ксения Александровна – аспирант 3 года обучения, кафедра общей химии ФГАОУ ВО НИУ «Белгородский государственный университет» Минобрнауки России. ORCID: 0000-0002-0711-3505. E-mail: 740890@bsu.edu.ru Писарев Дмитрий Иванович – доктор фармацевтических наук, доцент, профессор кафедры общей химии ФГАОУ ВО НИУ «Белгородский государственный университет» Минобрнауки России. ORCID: 0000-0002-2996-7712. E-mail: pisarev@bsu.edu.ru Малютина Анастасия Юрьевна – кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии ФГАОУ ВО НИУ «Белгородский государственный университет» Минобрнауки России. ORCID: 0000-0001-6170-2151. E-mail: malyutina_a@bsu.edu.ru Volume VII, Issue 1, 2019 Жилякова Елена Теодоровна – доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой фармацевтической технологии ФГАОУ ВО НИУ «Белгородский государственный университет» Минобрнауки России. E-mail: ezhilyakova@bsu.edu.ru Цветкова Зоя Евгеньевна – ассистент кафедры фармацевтической технологии ФГАОУ ВО НИУ «Белгородский государственный университет» Минобрнауки России. ORCID: 0000-0002-6358-2680. E-mail: tsvetkova_z@bsu.edu. ru Полковникова Юлия Александровна – кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет». ORCID: 0000-0003-0123-9526. E-mail: Julipolk@mail.ru 19 оригинальная статья DOI: 10.19163/2307-9266-2019-7-1-13-19 WORKING OUT QUALITY STANDARDS OF MODEL COMPOSITION SAMPLES OF GRANULATED DOSAGE FORM WITH GLUTATHIONE RESTORED K.A. Alekseeva1, D.I. Pisarev1, A.Yu. Malyutina1, E.T. Zhilyakova1, Z.E. Tsvetkova1, Yu.A. Polkovnikova2 Belgorod State National Research University 85, Pobeda Str., Belgorod, Russia, 308015 2 Voronezh State University 1, Universitetskaya Sq., Voronezh, Russia, 394006 1 E-mail: pisarev@bsu.edu.ru Received: 14.01.2019 Accepted for publication: 25.02.2019 Biologically active sulfur-containing compounds (BASC) exhibit pronounced antioxidant properties. Glutathione reduced (GSH) occupies a particular position among these compounds. It represents a key link in the 3 antioxidant systems of the body from the existing four. Based on the foregoing, a GSH-based dosage form with antioxidant properties was proposed. The aim of this study is to work out a model granulated dosage form based on GSH and methods of its analysis by means of pre-column derivatization with ortho-phthalic aldehyde. Materials and methods. GSH and granulated dosage form based on GSH obtained by wet granulation were used as the object of the study. Quantitative evaluation of GSH content in the obtained granules was carried out using pre-column derivatization by the method of reversed-phase high-performance chromatography (RP HPLC). Ortho-phthalic aldehyde was used as a derivatizing agent. A diode-array detector was used to detect the resulting derivative. Ortho-phthalic aldehyde was used as a derivatizing agent. A diode-matrix detector was used to find out the resulting derivative. Results. In the course of the work, a model dosage form was created – granules based on GSH. By reference to the recommendations on the dosage of the drug, the concentration of the active substance was selected. Lactose was chosen as an auxiliary component. Physical and technological characteristics of a model sample of granules with GSH and lactose as a filler were studied. A method of quantitative determination of GSH in granules using pre-column derivatization with ortho-phthalic aldehyde was developed and validated by HPLC. The method of quantitative determination of GSH in granules with the use of pre-column derivatization by ortho-phthalic aldehyde by HPLC was developed and validated. Conclusion. The developed granulated dosage form meets the requirements given in the pharmacopoeial item “Granules” according to the analyzed indicators. Using the validation evaluation it was established, that the developed methods for the quantitative determination of GSH in granules is correct, precise and specific. Keywords: reduced glutathione, ortho-phthalic aldehyde, granules, reverse phase high performance liquid chromatography, derivatization, validation For citation: K.A. Alekseeva, D.I. Pisarev, A.Yu. Malyutina, E.T. Zhilyakova, Z.E. Tsvetkova, Yu.A. Polkovnikovа. Working out quality standards of model composition samples of granulated dosage form with glutathione restored. pharmacy & Pharmacology. 2019;7(1):13-19. DOI:10.19163/2307-9266-2019-7-1-13-19 © К.А. Алексеева, Д.И. Писарев, А.Ю. Малютина, Е.Т. Жилякова, З.Е. Цветкова, Ю.А. Полковникова, 2019 Для цитирования: К.А. Алексеева, Д.И. Писарев, А.Ю. Малютина, Е.Т. Жилякова, З.Е. Цветкова, Ю.А. Полковникова. Разработка норм качества образцов модельного состава гранулированной лекарственной формы с глутатионом восстановленным. Фармация и фармакология. 2019;7(1):13-19. DOI:10.19163/2307-9266-2019-7-1-13-19 Том 7, Выпуск 1, 2019 13 Research Article ISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241 РАЗРАБОТКА НОРМ КАЧЕСТВА ОБРАЗЦОВ МОДЕЛЬНОГО СОСТАВА ГРАНУЛИРОВАННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ С ГЛУТАТИОНОМ ВОССТАНОВЛЕННЫМ К.А. Алексеева1, Д.И. Писарев1, А.Ю. Малютина1, Е.Т. Жилякова1, З.Е. Цветкова1, Ю.А. Полковникова2 ФГАОУ ВО НИУ «Белгородский государственный университет» Минобрнауки России 308015, Россия, г. Белгород, ул. Победы, 85 2 ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» Минобрнауки России 394018, Россия, г. Воронеж, Университетская пл., 1 E-mail: pisarev@bsu.edu.ru 1 Поступила в редакцию: 14.01.2019 Принята к печати: 25.02.2019 Биологически активные серосодержащие соединения (БАСС) проявляют ярко выраженные антиоксидантные свойства. Особое положение из числа данных соединений занимает глутатион восстановленный (GSH). Он представляет собой ключевое звено 3-х антиоксидантных систем организма из существующих четырех. Исходя из вышесказанного, нами была предложена лекарственная форма на основе GSH, обладающая антиоксидантными свойствами. Целью данного исследования является разработка модельной гранулированной лекарственной формы на основе GSH и методики ее анализа с помощью предколоночной дериватизации орто-фталевым альдегидом. Материалы и методы. В качестве объекта исследования использовали GSH и гранулированную лекарственную форму на основе GSH, полученную методом влажного гранулирования. Оценку количественного содержания GSH в полученных гранулах, проводился с помощью предколоночной дериватизации методом обращено-фазной высокоэффективной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). В качестве дериватизурующего агента использован орто-фталевый альдегид. Для обнаружения образовавшегося деривата был применен диодно-матричный детектор. Результаты. В ходе работы была создана модельная лекарственная форма – гранулы на основе GSH. Исходя из рекомендаций по дозировке препарата подобрана концентрация действующего вещества. В качестве вспомогательного компонента была выбрана лактоза. Изучены физические и технологические характеристики модельного образца гранул с GSH и лактозой в качестве наполнителя. Разработана и отвалидирована методика количественного определения GSH в гранулах с использованием предколоночной дериватизации орто-фталевым альдегидом методом ВЭЖХ. Заключение. Разработанная гранулированная лекарственная форма по анализируемым показателям соответствует требованиям, приведенным в ОФС «Гранулы». При помощи валидационной оценки установлено, что разработанная методика количественного определения GSH в гранулах является правильной, прецизионной и специфичной. Ключевые слова: глутатион восстановленный, орто-фталевый альдегид, гранулы, обращённо-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография, дериватизация, валидация INTRODUCTION Reduced glutathione (GSH) is Tripeptide containing amino acid residues of L-glutamic acid, glycine and L-cysteine. GSH is one of the non-enzymatic components involved in the antioxidant protection of living organisms. It acts as an effective antiradical agent and plays a key role in the life cycle of cells, causing their protection from free radicals, hydroperoxides and xenobiotics [1, 2]. GSH status is an indicator of cell functionality and viability [3, 4]. The exhaustion or change of its level inside the cell provokes a number of diseases such as cancer, neurodegenerative, cardiovascular [5, 6]. In vitro and in vivo studies confirm that GSH deficiency can cause cell death and mitochondrial damage due to an increase in the number of toxic forms of oxygen and an increase in the number of free radicals [7]. GSH is able 14 to prevent the destruction of cells by conjugation with toxic substances and their metabolites. Glutathione conjugation occupies one of the central places in the mechanisms of biotransformation of a number of xenobiotics [8–10]. Nowadays, more than forty types of chemical compounds that react with GSH are known. The mating factor of such reactions is the presence of an electrophilic center capable of reacting with the SH-group of GSH [11]. Consequently, the xenobiotic detoxification system involving GSH plays a key role in the formation of the body’s resistance to various influences and is one of the most important defense mechanisms of the cell. Hereby, GSH conjugates with xenobiotics are less reactive and more hydrophilic than the initial substances, so they are less toxic and eliminate from the body faster [12, 13]. GSH is also able to prevent the introduction of lipophilic Volume VII, Issue 1, 2019 оригинальная статья DOI: 10.19163/2307-9266-2019-7-1-13-19 toxicants into lipid bilayer membranes [14]. GSH has a membrane stabilizing activity effect on the hepatocyte, increases the activity of enzymes and promotes detoxification and regenerative activity of the liver through the neutralization of free radicals [15]. Taking into account the spectrum of glutathione pharmacological activity, we have proposed a dosage form with GSH, which has pronounced antioxidant properties. MATERIALS AND METHODS As the object of the study, glutathione reduced (CAS No. 70-18-8, EC No. 2007254, Applichem, Germany) and the excipient, lactose, were used The choice of this component is due to the possibility of its application as a filler, a reagent and an agent that regulates some technological characteristics of the granules (stability, disintegration, etc.). Advantages of lactose as an excipient [16]: – inert material, high purity, neutral color; – moisture resistance; – physical and chemical stability; – it is well subjected to grinding and sieving; – its high degree of crystallization, low degree of amorphism. The wetting angle of GSH with water is less than 90°, it is 45±5°, i.e. GSH is a hydrophilic substance, so purified water was used as a humidifier in the model sample of granules. To obtain a model sample of granules, a wet granulation method was used. The procedure for the formation of granules occurs as a result of pushing the moistened mass through a perforated sieve. The technological characteristics of the obtained granules were determined on the basis of the following techniques. The degree of the granules flowability was established by the method of the State Pharmacopoeia of Russian Federation (SPh), XIV-th edition (pharmacopoeial item “Powder Flow”) using a V-12A (VZZTO) vibrating device. The sizes of the obtained granules were determined using the sieve analysis in accordance with SPh, XIV-th edition (pharmacopoeial item “Wet sieve residue test”). The test of “disintegration” was carried out on the “Swinging basket” disintegration tester in accordance with SPh, XIV-th edition (pharmacopoeial item “Granules”). The results of the “Dissolution” test were noted on the “Impeller” dissolution tester in accordance with pharmacopoeial item 1.4.2.0014.15. Quantitative determination of GSH in a granular dosage form was performed by method of reverse phase high-performance chromatography using pre-column derivatization of this therapeutic agent by ortho-phthalic aldehyde [17]. Том 7, Выпуск 1, 2019 The analysis was performed on the chromatograph “Agilent Technologies 1200 Infinity” with automatic sampler, vacuum microdoser, gradient pump and thermostat. The gradient chromatography conditions were: mobile phase (A) – 1% aqueous solution of formic acid, (B) – ethyl alcohol 95%; column: Ascentis express C18 2.7 dm × 100 mm × 4.6 mm; mobile phase speed – 0.5 ml/min.; column temperature was +35±0.01°C; sample volume – 1 µl. GSH lacks the chromophores suitable for its analysis by UV spectroscopy and HPLC with diode array detection. In this regard, we proposed the analysis of GSH by HPLC using chemical transformation with a derivatizing agent – ortho-phthalic aldehyde. As a result of the reaction, the obtained derivative of GSH and ortho-phthalic aldehyde acquires a chromophore label, which is fixed during chromatographic analysis using diode-matrix detection. GSH has no chromophores suitable for its analysis by UV spectroscopy and HPLC with diode-matrix detection. In this regard, we propose the analysis of GSH by HPLC method by its chemical transformation by derivatizing agent-ortho-phthalic aldehyde. As a result of the reaction, the resulting GSH derivative and ortho-phthal aldehyde acquires a chromophore label, which is fixed during chromatographic analysis by diode-matrix detection. Derivatization methods of glutathione-based granules 1 ml of a 0.1% solution of glutathione granules in a 0.05 M of aqueous solution of sodium tetraborate was placed in a 10 ml analysis bottle, 1 ml of a 0.35% solution of o-phthalaldehyde in ethanol was added, shaken thoroughly and immediately chromatographed. Preparation of model test solutions for validation assessment methods The characteristics of correctness and precision were investigated on model samples of the preparation with glutathione concentrations that correspond to 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115% and 120% of their content relative to the nominal value. For the preparation of model samples of the drug a volumetric flasks with a capacity of 25 ml was used. The batches were taken directly from the components of the drug. The mass of the batches and the concentration of the resulting solutions of glutathione are shown in Table 2. RESULTS AND DISCUSSION On the base of the experimental data obtained, a model dosage form – granules based on glutathione – was created. The concentration of active substances was selected by reference to the recommendations of the 15 Research Article ISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241 dosage of the drug (0.05–0.5 g). The composition of the granules in a single-dose package (3.0 g) is as folows: glutathione 0.1 g, lactose 2.9 g. At the next stage, organo- leptic, physical and technological parameters of granules based on glutathione were determined. The results of the study are presented in Table 1. Table 1. Pharmaceutical and technological characteristics of granulated model dosage form based on GSH Indicator under study Меthods of determination Values obtained experimentally Granule size Pharmacopoeial item 1.1.0015.15 1.0–1.2 mm Granule form Pharmacopoeial item 1.2.1.0009.15 Anisodiametric (elongated) Pharmacopoeial item 1.4.2.0016.15 460.10 ±1.31 kg/m3 (Light) Flowability Pharmacopoeial item 1.4.2.0016.15 7.14 ±0.25 g/sec (Good) Disintegration Pharmacopoeial item 1.4.2.0013.15 Pharmacopoeial item 1.4.2.0004.15 Tapped density Stability Glutathione release Water solubility of granules Weight loss on drying Uniformity of dosing Glutathione content, g Pharmacopoeial item 1.4.2.0014.15 Pharmacopoeial item 1.2.1.0005.15 4±2 min. Mot less than 97% 98.5±0.5% 75% (during 45 min.)) 99.9±0.50% (during 15 min.) Soluble (1:30) Pharmacopoeial item 1.2.1.0010.15 Pharmacopoeial item 1.4.2.0008.15 Reverse phase highly efficient liquid chromatography 100.0±0.39% According to the data of Table 1, glutathione-based granules are elongated particles of 1.0-1.2 mm. They belong to light grains and have a satisfactory flowability. According to the indicators given in the pharmacopoeial item “Granules” (disintegration, uniformity of dosage, dissolution) this dosage form meets the requirements. Glutathione-based granules can be used to fill capsules, as well as an independent dosage form. The worked out granules are soluble and highly soluble in warm water. Glutathione-based granules are an oral dosage form with preliminary dissolution in liquid. For the purpose of quantitative determination of glutathione recovered in a granulated dosage form, a method 16 Reference values Coarse fraction:> 1.2 mm Average fraction: 1.2 mm Fine fraction: 1.0 mm Elongated: >3:1 Lamellar: 3:1 Equiaxed: 1:1 Very heavy: >2000 kg/m3 Heavy: 1100–2000 kg/m3 Medium: 600–1100 kg/m3 Light: < 600 кг/м3 Excellent: 8.6–12.0 g/sec Good: 6.6–8.5 g/sec Satisfactory: 3.0–6.5 g/sec Permissible: 2.0–3.0 g/sec Poor: 1.0–2.0 g/sec Very poor: <1,0 g/sec Up to 15 min. Highly water soluble: up to 1 ml/g Freely soluble: 1–10 ml/g Soluble: 10–30 ml/g; Sparingly soluble: 30–100 ml/g Slightly soluble: 100–1000 ml/g; Very slightly soluble: 1000–10000 ml/g Practicaly insoluble: more than 10000 ml/g 1.5±1% In progress 100.09±0.39% for pre-column derivatization with ortho-phthalic aldehyde has been developed. Derivatization with the specified modifier usually occurs within 2-3 minutes. The resulting product is easily detected using a diode array or a fluorimetric detector. The wavelength of the resulting derivative is usually λ – 337 nm. The molar ratios of o-phthalaldehyde and glutathione are 3.5: 1. When chromatographing OPHA-derivative of glutathione, there is one peak with a retention time of 18.066 minutes. The UV spectrum of the derivative exhibits several absorption maxima, the most specific of which is λmax – 336 mn. At the same time, the peak of the derivatizer itself is not visible, due to a different maximum absorption of the derivative (Fig. 1). Volume VII, Issue 1, 2019 оригинальная статья DOI: 10.19163/2307-9266-2019-7-1-13-19 Figure 1. UV spectrum of o-phthalaldehyde derivative with GSH at the wavelength of 336 nm in a granulated dosage form To confirm the possibility of using the proposed method of identification and quantitative determination of glutathione by the method of pre-column derivatization with ortho-phthalic aldehyde in granules, a validation assessment was carried out according to the characteristics: specificity, linearity, convergence (precision) and correctness [18]. Validation parameters of correctness, precision and linearity were studied on the preparation solutions with glutathione concentrations in the range of 80–120% of the nominal content of in granulated glutathione. This covers the whole range of concentrations and determines the minimum permissible concentration of the methods for quantitative determination [19]. The acceptance criteria were calculated for b=10%, therefore, the maximum value of the total uncertainty of the results of the methods (ΔAs) should not exceed the value of B×0.32=3.2% [20]. Table 2. Mass of the batches and concentrations of glutathione reduced in model granulated samples Number Mass of the preparation batches Content of glutathione reduced of model sample – granules with glutathione, g in the batch, g 1 0/6022 0.02000 2 0/6360 0.02120 3 0.6760 0.02250 4 0.7125 0.02370 5 0.7512 0.02500 6 0.7875 0.02620 7 0.8265 0.02755 8 0.8630 0.02876 9 0.9012 0.03000 The results of chromatography, the values of certain concentrations of glutathione in model samples and the calculation of the metrological characteristics of the methods are presented in Table 3. From the information given in Table 3 it follows, that the methods of quantitative determination of glutathione does not have a statistically significant systematic error. Том 7, Выпуск 1, 2019 Concentration of glutathione reduced relative to nominal, % 80.41 85.42 90.85 95.07 100.02 105.20 110.03 114.96 119.92 Thus, validation tests of the methods of quantitative determination of glutathione in granules by the method of pre-column derivatization with ortho-phthalic aldehyde showed that the validation parameters correspond to the accepted quantitative criteria for correctness, convergence in the concentration range from 80% to 120% of the nominal glutathione content in the granulated dosage form. 17 Research Article ISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241 Table 3. Validation results of the methods for quantitative determination of glutathione in model solutions of granules Solution number 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Average, Z, % % of Glutathione taken, compared to the concentration of the reference solution (X,%) 80.41 85.42 90.85 95.07 100.02 105.20 110.03 114.96 119.92 % of Glutathione found, compared to the concentration of the reference solution (Y,%) 80.39 85.49 90.78 95.23 100.21 105.01 110.18 115.15 120.36 Relative standard deviation, Sz, % Glutathione found to Glutathione taken ratio Z = 100*(Y/X) 99.98 100.01 99.92 100.17 100.19 99.82 100.14 100.17 100.37 100.09 0.17% Relative confidence interval, Δ, % = t (95%, 7)*Sz 0.39 Critical value for convergence of results, maxΔAs, %, at B±10% 3.2 Systematic error, δ = Zср–100 0.09 Criterion of insignificance of the system error δ≤Δ/3 General conclusion about the methods In progress Correct CONCLUSION In the course of the work, a model dosage form was created – glutathione-based granules. Physical and technological characteristics of the model sample of granules with GSH and lactose as a filler have been studied. Methods of quantitative determination of GSH in granules using pre-column derivatization with ortho-phthalaldehyde by HPLC has been worked out and validated. The results of the validation assessment showed that this methods complies with all the validation parameters: it is correct, precise, specific and linear in the analytical field. REFERENCES 1. Winterbourn CC. Superoxide as an intracellular radical sink. Free Radic. Free Radic Biol Med. 1993 Jan;14(1):85–90. 2. Cazanave S, Berson A, Haouzi D, et al. High hepatic glutathione stores alleviate Fas-induced apoptosis in mice. J Hepatol. 2007 May;46(5):858–68. 3. Go YM, Jones DP. Redox compartmentalization in eukaryotic cells. Biochim Biophys Acta. 2008 Nov;1780(11):1273–90. DOI: 10.1016/j. bbagen.2008.01.011. 4. Zimmermann AK1, Loucks FA, Schroeder EK, Bouchard RJ, et al. Glutathione binding to the Bcl2 homology-3 domain groove: a molecular basis for Bcl-2 antioxidant function at mitochondria. J Biol Chem. 2007 Oct 5;282(40):29296–304. DOI: 10.1074/jbc.M702853200. 5. Arnér ES, Holmgren A. Physiological functions of thioredoxin and thioredoxin reductase. Eur J Biochem. 2000 Oct;267(20):6102–9. DOI: https://doi. org/10.1046/j.1432-1327.2000.01701.x. 6. Iles KE, Liu RM. Mechanisms of glutamate cysteine ligase (GCL) induction by 4-hydroxynonenal. Free Radic Biol Med. 2005 Mar 1;38(5):547-56. DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2004.11.012. 7. Corbucci G.G. The role of reduced glutathione during the course of acute haemolysis in glucose-6-phosphate dehydrogenase deficient patients: clinical and pharmacodynamic aspects. Int J Clin Pharmacol Res. 1990;10(5):305–10. 8. Golikov SN, Sanockij IV, Tiunov LA. Obshchie mekhanizmy toksicheskogo dejstviya [General mechanisms of toxic action]. L:Medicina.1986. 280p. Russian. 9. Eropkin MYu, Eropkina EM. Kultury kletok kak modelnaya sistema issledovaniya toksichnosti i skrininga citoprotektornyh preparatov [Cultures of cells as a model system for the study of toxicity and screening of cytoprotective drugs]. SPb:MORSAR AB. 2003. 239p. Russian. 10. Tiunov LA. Mekhanizmy estestvennoj detoksikacii I antioksidantnoj zashchity [Mechanisms of natural detoxification and antioxidant protection]. Bulletin RAMS. 1995;3:9–13. Russian. 11. Tiunov LA, Ivanova VA. Rol glutationa v processah detoksikacii [The role of glutathione in detoxification processes]. Bulletin AMS USSR. 1988;1:62–9. Russian. 12. Harman D. Free-radical theory of aging: inversing the functional life span. Ann N Y Acad Sci. 2006 May;1067:10–21. DOI: 10.1196/annals.1354.003. 13. Lőrincz T, Szarka A. The determination of hepatic 18 Volume VII, Issue 1, 2019 оригинальная статья DOI: 10.19163/2307-9266-2019-7-1-13-19 glutathione at tissue and subcellular level. J Pharmacol Toxicol Methods. 2017 Nov;88(Pt 1):32–39. DOI: 10.1016/j.vascn.2017.05.004. 14. Kanekal S, Kehrer JP. Metabolism of cyclophosphamide by lipoxygenases. Drug Metab Dispos. 1994 Jan-Feb;22(1):74–8. 15. Traverso N, Ricciarelli R, Marengo B, et al. Role of glutathione in cancer progression and chemoresistance // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2013;2013. Article ID 972913. DOI: https://doi. org/10.1155/2013/972913. 16. Polyakov NA, Astrahanova MM, Dubinskaya VA, Bykov VA. Gidrataciya i termodinamicheskie harakteristiki obrazcov alfa laktozy poluchennye s ispolzovaniem novyh tekhnologij [Hydration and thermodynamic characteristics α-lactose, received on new technologies]. Problems of Biological, Medical and Pharmaceutical Chemistry. 2011;8:7–11. Russian. 17. Lenton KJ, Therriault H, Wagner JR. Analysis of glutathione and glutathione disulfide in whole cells and mitochondria by postcolumn derivatization high-performance liquid chromatography with ortho-phthalaldehyde. Anal Biochem. 1999 Oct 1;274(1):125–30. DOI: 10.1006/abio.1999.4258. 18. Obshchaya farmakopejnaya statya OFS 1-1-0012-15 validaciya analiticheskih metodik [Pharmacopoeial item OFS.1.1.0012.15 “Validation of analytical methods”]. State Pharmacopoeia of Russian Federation XIV-th edition. Moscow;2018. Russian. 19. Rukovodstvo po validacii metodik analiza lekarstvennyh sredstv. Metodicheskie rekomendacii [Guidance on the validation of drug analysis techniques]. Moscow,2007:6–92. Russian. 20. Obshchaya farmakopejnaya statya OFS 1-1-0013-15 “Statisticheskaya obrabotka rezultatov himicheskogo ehksperimenta” [Pharmacopoeial item OFS.1.1.0013.15 “Statistical processing of the results of a chemical experiment”]. State Pharmacopoeia of Russian Federation XIV-th edition. Moscow; 2018. Russian. Conflict of interest The authors declare no conflict of interest. Authors Alekseeva Kseniya Aleksandrovna – post-graduate student, Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy Department, Belgorod State University. ORCID: 0000-0002-0711-3505. E-mail: 740890@bsu.edu.ru Pisarev Dmitriy Ivanovich – PhD (Pharmacy), Associate Professor, Professor of General chemistry Department, Belgorod State University. ORCID: 0000-0002-2996-7712. E-mail: pisarev@bsu.edu.ru Malyutina Anastasiya Yurevna – PhD (Pharmacy), Associate Professor of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy Department, Belgorod State National Research University. ORCID: 0000-0001-6170-2151. E-mail: malyutina_a@bsu.edu.ru Том 7, Выпуск 1, 2019 Zhilyakova Elena Teodorovna – Doctor of Sciences (Pharmacy), Professor, Head of Pharmaceutical Technology Department, Belgorod State University. E-mail: ezhilyakova@bsu.edu.ru Tsvetkova Zoya Evgenievna – Assistant, Pharmaceutical Technology Department, Belgorod State University. ORCID: 0000-0002-6358-2680. E-mail: tsvetkova_z@bsu.edu.ru Yulia Aleksandrovna Polkovnikova – PhD (Pharmacy), Associate Professor, Voronezh State University. ORCID: 0000-0003-0123-9526. E-mail:Juli-polk@ mail.ru 19

About the authors

K. A. Alekseeva

Belgorod State National Research University

Email: 740890@bsu.edu.ru

D. I. Pisarev

Belgorod State National Research University

Email: pisarev@bsu.edu.ru

A. Yu. Malyutina

Belgorod State National Research University

Email: malyutina_a@bsu.edu.ru

E. T. Zhilyakova

Belgorod State National Research University

Email: ezhilyakova@bsu.edu.ru

Z. E. Tsvetkova

Belgorod State National Research University

Email: tsvetkova_z@bsu.edu.ru

Yu. A. Polkovnikova

Voronezh State University

Email: Julipolk@mail.ru

References

Supplementary files