Correction of psychological and neurological signs of alcohol hangover in rats with acetylcysteine

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Острое употребление больших количеств этилового спирта влечет глубокие негативные социально-экономические последствия. По данным Центров по контролю и профилактике заболеваний США за 2010 г., экономические потери, обусловленные снижением производительности труда из-за употребления алкоголя, составили 179 миллиардов долларов. Несмотря на большие социально-экономические издержки и затраты медицинских служб на терапию похмельного синдрома и его последствий, эта проблема пользуется относительно небольшим интересом среди исследователей, в результате этот крайне распространённый симптомокомплекс в своём патогенезе до сих пор имеет много необъясненных аспектов. Для улучшения методов его профилактики или фармакотерапии, необходимо более глубокое понимание патологических процессов, которые протекают в организме при развитии подобного состояния [1, 2]. В настоящее время этот синдром определяется как общий дискомфорт, возникающий после полного метаболизма ранее принятого алкоголя (т.е. в ситуации, когда алкоголь не может быть определён в крови). Психоневрологические нарушения, возникающие после употребления больших доз алкоголя, представляют собой не устойчивое состояние организма, а развивающийся и медленно угасающий процесс, что особенно важно учитывать людям, профессиональная деятельность которых требует внимания и скорости принятия решений с риском возникновения угрожающих ситуаций (например, водители и операторы сложных механизмов) [3]. Наличие похмелья стороннему человеку трудно обнаружить и отличить от симптомов некоторых заболеваний (головная боль напряжения, пищевое отравление, артериальная гипертензия), что при определенных условиях может представлять угрозу для окружающих. В частности, профессиональные водители, нахо-дящиеся в состоянии посталкогольной интоксикации совершают значительно больше серьёзных ошибок при вождении в симуляционных условиях (на симуляторе автомобиля), чаще и на большую величину превышают скорость, игнорируют дорожные знаки и указатели, не замечают резко возникающие помехи, медленнее и/или неадекватно реагируют при возникновении аварийно-опасных ситуаций [4, 5]. Важно отметить, что в подобном состоянии часто повышается раздражительность и агрессивность, что может быть связано с выраженным болевым синдромом и/или повышением уровня тестостерона, что было отмечено в некоторых исследованиях [6, 7], метаболизм которого происходит в печени и может изменяться с истощением внутриклеточных субстратов, вызванных поэтапным и интенсивным процессом биотрансформации, вначале алкоголя, а затем его метаболитов. Похмелье характеризуется развитием комплекса негативных симптомов наиболее распространёнными из которых являются: головная боль, тошнота, рвота, диарея, озноб, лихорадка, сонливость, тремор, раздражительность, агрессивность [8]. В коллективах, сотрудники которых на условиях анонимности сообщали о выполнении служебных обязанностей в состоянии на утро после употребления больших доз алкоголя, чаще возникали межличностные конфликты, а общая производительность труда была низкой [9]. Употребление этанола, это пример добровольного, в значительной степени бесконтрольного, применения самого распространённого и, вероятно, наиболее изученного психотропного средства [10]. При массе стрессогенных факторов современной жизни антидепресантные, психостимулирующие, растормаживающие и гедонические эффекты этилового спирта часто становятся причиной злоупотребления. Хотя алкоголь часто употребляется в дозах, вызывающих похмелье, универсальные признаки, позволившие бы определить группу риска, отсутствуют. По этой причине негативные явления, связанные с его употреблением могут возникнуть у абсолютно любого человека (вне зависимости от его социального, финансового или правового статуса, ментального и физического уровня развития). В соответствии с результатами некоторых социологических исследований, 75% людей, которые употребляли алкогольные напитки до состояния опьянения, пережили похмелье хотя бы один раз, 15% опрошенных отметили, что последний подобный эпизод у них был в предыдущем месяце. Около 50% лиц, постоянно употребляющих этанол (те, кто потребляет один или два напитка в день, один напиток - эквивалент по дозе 50 г чистого алкоголя [11]), имеют привычное похмелье. Среди людей, открыто сообщающих о факте частого употребления этилового спирта, 40% заявляют, что психоневрологические постинтоксикационные последствия у них возникают ежемесячно или чаще. У больных алкоголизмом их распространенность ниже и составляет 20-25%. До 87% студентов университетов в течение года испытывают один или более эпизодов похмелья, при этом в многочисленных исследованиях доказано негативное влияние этого симптомокомплекса на когнитивную деятельность [12]. Фармакотерапия является единственным эффективным способом устранения последствий острого чрезмерного употребления алкогольных напитков, однако современный фармацевтический рынок располагает ограниченным количеством лекарственных препаратов для профилактики и лечения данного состояния [13]. Ситуация осложняется не только отсутствием согласованных мнений профессионального сообщества относительно патогенеза похмелья, но и трудностями, возникающими при инициации и проведении доклинических исследований. Одним из перспективных направлений в терапии похмелья является разработка средств, ускоряющих метаболизм ацетальдегида. Среди соединений, обладающих подобным действием, можно выделить ацетилцистеин, который является предшественником глутатиона, важнейшего регулятора окислительно-восстановительных процессов в клетках, в том числе и в гепатоцитах. Этиловый спирт метаболизируется до ацетальдегида, оказывающего общетоксическое действие, проявлением которого и является похмелье. Глутатион инактивирует свободные радикалы кислорода, образующиеся в митохондриях гепатоцитов в процессах их функционирования, образование которых зависит от интенсивности течения окислительно-восстановительных реакций. Поскольку метаболизм алкоголя протекает в несколько стадий (алкоголь - ацетальдегид - уксусная кислота) гепатоциты длительное время пребывают в условиях интенсификации метаболических процессов, когда в организм человека попадает большое его количество, что сопровождаются образованием большого числа активных форм кислорода и реактивных метаболитов, инактивируемых глутатионом. В подобной ситуации не исключено замедление метаболизма ацетальдегида из-за возникшего истощения запасов восстановленного глутатиона, поэтому применение веществ, способных повышать содержание последнего, может способствовать активизации естественных детоксикационных систем, ускорить метаболизм ацетальдегида и облегчить похмельный синдром. Перспективным может стать применение с данной целью ацетилцистеина, который способен повышать содержание восстановленного глутатиона [14]. Целью данного исследования стало экспериментальное обоснование применения ацетилцистеина в качестве предшественника глутатиона для снижения выраженности психоневрологических и когнитивных нарушений, возникающих на фоне острой алкогольной интоксикации.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Животные Все эксперименты были выполнены в соответствии с законодательством Российской Федерации и техническими стандартами Евразийского Экономического Союза по надлежащей лабораторной практике (ГОСТ Р 53434-2009, ГОСТ Р 51000.4-2011). Протокол исследования одобрен Региональным независимым этическим комитетом, регистрационный номер: ИРБ 00005839 IORG 0004900 (OHRP), о чем свидетельствует выписка из протокола №132 от 20 мая 2019 г. Заседания Комиссии по экспертизе исследования Регионального этического комитета при ФГБОУ ВО ВолгГМУ. Работу выполнили на самцах крыс линии Wistar (масса тела 300-350 г, питомник ФГУП «ПЛЖ «Рапполово»). После поступления из питомника животных помещали на карантин длительностью 14 дней в виварий ВолгГМУ, в помещении которого крысы содержались на протяжении эксперимента. Крыс содержали при 20 ± 2°C в условиях 40-60% влажности в условиях сменяющегося цикла день/ночь (12/12 ч) с неограниченным доступом к корму и воде. Дизайн исследования До моделирования алкогольной интоксикации все крысы предварительно были обучены навыку поиска затопленной платформы в водном лабиринте Морриса, а также навыку пассивного избегания в тесте УРПИ (обучение в лабиринте Морриса заняло 4 предшествующих дня, а обучение и контрольное воспроизведение в УРПИ - 2 дня). Животных распределили на 3 группы по 10 особей: 1. Интактная группа - физиологический раствор (15 мл/кг в/б и 5 мл/кг per os) 2. Контрольная группа - этанол (3 г/кг) + физиологический раствор (5 мл/кг); 3. Опытная группа - этанол (3 г/кг) + ацетилцистеин (1 г/кг); Крысам из первой группы (интактная группа) вводили физиологический раствор (в/б и per os). Крысам контрольной и опытной группы однократно вводили 20% водный раствор этанола в дозе 3 г/кг (в/б), а затем (после пробуждения и фиксации исходных параметров) однократно вводили соответственно физиологический раствор (ООО «Гематек», РФ) или водный раствор ацетилцистеина (ЗАО «Сандоз», РФ) в дозе 1 г/кг (per os). Объем растворов при внутрибрюшинном и внутрижелудочном введении составлял 15 и 5 мл/кг соответственно. После введения этанола у животных регистрировали латентный период потери установочного рефлекса (способности вставать и опираться на конечности после переворота на спину) [15]. Продолжительность сна у животных составляла 8 ч ± 30 мин. В течение 30 минут после пробуждения у животных оценивали исходный уровень психоневрологического и когнитивного дефицита с использованием шкалы «Combs and D’Alecy» и тестов: Адгезивный тест, Открытое поле, УРПИ и лабиринт Морриса. Затем крысам внутрижелудочно (в соответствии с группой) вводили ацетилцистеин или физиологический раствор. Животных, которые не просыпались спустя 8 часов 30 минут после введения этанола, исключали из эксперимента. Спустя 3 часа тесты повторяли: неврологический дефицит оценивали по балльной шкале «Combs and D’Alecy» [16], в Адгезивном тесте у животных фиксировали скорость обнаружения и удаления инородного предмета незаметно закреплённого на волярной поверхности передних лап (длительность теста: 3 мин) [17], в Открытом поле оценивали двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность [18], а также оценивали когнитивную функцию: учитывали латентный период захода в тёмный отсек установки УРПИ [18] и скорость нахождения площадки в водном лабиринте Морриса [19]. После эвтаназии (декапитация под наркозом золетилом/ксилазином в дозе 20/8 мг/кг) у животных отбирали образцы тканей печени для последующего анализа. Концентрацию восстановленного глутатиона измеряли в реакции восстановления 5,5-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) [20]. Все реакции проводили в трипликатах. Статистическая обработка Статистическую обработку полученных результатов проводили методами описательной и аналитической статистики. Распределение количественных показателей оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка. Межгрупповые различия оценивали при помощи однофакторного дисперсионного анализа с пост-тестом Ньюмена-Кеулса, а цифровые значения представляли в виде среднего арифметического значения и стандартной ошибки среднего арифметического (если не указано иное). Для оценки различий категориальных данных использовали критерий хи-квадрат. РЕЗУЛЬТАТЫ После внутрибрюшинного введения этанола подопытные крысы засыпали в течение нескольких минут и их сон длился в среднем 8 часов ± 30 минут. По времени наступления и продолжительности сна все отобранные в эксперимент животные были сопоставимы. Постинтоксикационное состояние животных характеризовалось угнетённым поведением, они были вялые и медленно двигались, отмечалась выраженная сонливость (животные чаще пребывали в клетке с закрытыми глазами, прикосновение к ним вызывало определённую реакцию, сопровождающую непродолжительным движением). Всё это нашло отражение при проведении теста Открытое поле, в котором у животных отмечалась низкая ориентировочно-исследовательская и двигательная активность. Через 3 часа после проведения терапии в контрольной группе сохранились низкие показатели в тесте Открытое поле в то время, как у животных, которым перорально ввели водный раствор ацетилцистеина двигательная и ориентировочно-исследовательская активности оказались значительно выше (Рисунок 1). Таким образом, у животных, которым вводили ацетилцистеин, наблюдалось быстрое восстановление локомоторной и исследовательской активности после алкогольной интоксикации. При оценке неврологического дефицита по шкале «Combs and D’ Alecy» после пробуждения у животных отмечали симптомы тяжелого психоневрологического дефицита, выраженность которых снизилась через 3 часа после перорального введения физиологического раствора и значительно уменьшились после введения ацетилцистеина (Рисунок 2, А). При оценке сенсорно-моторной функции в адгезивном тесте, после пробуждения животные не реагировали на инородный предмет, закрепленный на волярной поверхности их лап. Через 3 часа после первого тестирования и проведения лечения у животных, перенесших острое алкогольное отравление пероральное введение физиологического раствора не улучшало их сенсорно-моторную функцию поскольку только 2 из 10 животных были способны удалить стикер (как минимум с одной лапы), в то время как в группе, получавшей ацетилцистеин 7 из 10 животных обнаружили и удалили инородный предмет минимум с одной лапы (p < 0,05) и сделали это значительно (p < 0,05) быстрее, чем в предыдущий раз (Рисунок 2, Б). Все животные в течение 4 дней перед внутрибрюшинным введением алкоголя обучались навыку поиска затопленной площадки в водном лабиринте Морриса, а за 2 дня до алкоголизации у них формировался условный рефлекс пассивного избегания темного отсека установки УРПИ. Все крысы после пробуждения, находящиеся в состоянии, которое возможно трактовать как похмелье, в одинаковой степени плохо помнили место расположения площадки в водном лабиринте Морриса (Рисунок 3, А). В установке УРПИ эти животные демонстрировали крайне низкую двигательную активность, пребывая в одном из углов, практически не исследуя её внутреннее пространство, поэтому объективно оценить сохранность их мнестической функции в тесте УРПИ после пробуждения довольно трудно. При тестировании спустя 3 часа после проведения лечения было отмечено, что пероральное введение физиологического раствора практически не влияло на результаты поведения животных в водном лабиринте Морриса и на сохранность условного рефлекса в УРПИ, в то время как крысы, которым ввели ацетилцистеин значительно быстрее и в большем количестве находили площадку в водном лабиринте Морриса и избегали посещения тёмного отсека в тесте УРПИ (Рисунок 3А, Б). По результатам тестирования крыс в водном лабиринте Морриса и тесте УРПИ можно сделать вывод о том, что острое введение больших доз алкоголя животным вызывает у них выраженное нарушение памяти, что в значительной степени нивелируется введением ацетилцистеина. На завершающем этапе исследования после эвтаназии производили забор образцов тканей печени для определения содержание глутатиона. У крыс из контрольной группы, которым вводили этанол и физиологический раствор, содержание глутатиона в гомогенатах печени достигли 96,5 ± 3,11 мг/г ткани (против 117,4 ± 2,95 мг/г ткани у интактных живот-ных; p < 0,0001). У крыс, которым вводили ацетилцистеин, содержание глутатиона (111,4 ± 3,52 мг/г ткани) было лишь незначительно ниже, чем у животных интактной группы и значимо выше, чем у животных контрольной группы (p < 0,05; Рисунок 4). Таким образом, однократное введение ацетилцистеина повышало содержание восстановленного глутатиона в печени и, вероятно, способствовало снижению выраженности алкогольной интоксикации. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Употребление алкоголя в современном обществе очень распространено ввиду увеличения стрессогенной нагрузки и доступности алкоголя. Похмелье - частое нежелательное явление, сопровождающее прием алкогольных напитков, который, несмотря на распространённость, редко входит в круг интересов медицинской науки. Есть несколько социальных и клинических негативных последствий, связанных с появлением похмелья, таких как экономические затраты, связанные с неэффективной работой или учебой [1, 2]. Окисление этанола под действием алкогольдегидрогеназы приводит к образованию ацетальдегида, который превращается в ацетат; обе эти последовательные и потом параллельные реакции уменьшают никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и увеличивают концентрацию НАДН, снижая количество восстановленного глутатиона [21]. Повышение НАДН вызывает ряд метаболических нарушений, включая гиперлактацидемию, которая способствует ацидозу и снижает экскрецию мочевой кислоты с мочой. Это приводит к вторичной гиперурикемии, которая усугубляется вызванным алкоголем кетозом и усиливает ацетат-опосредованный распад АТФ. НАДН также препятствует глюконеогенезу, тем самым способствуя гипогликемии, повышает уровень α-глицерофосфата, ингибирует цикл Кребса и окисление жирных кислот. Ингибирование окисления жирных кислот способствует стеатозу и гиперлипидемии с участием всех классов липидов. Ацетальдегид оказывает прямое токсическое действие на клетку и её органеллы, препятствует восстановлению алкилированных нуклеопротеинов, снижает активность ключевых ферментов и заметно снижает эффективность метаболизма кислорода в митохондриях. Кроме того, ацетальдегид способствует гибели клеток, истощая уровень восстановленного глутатиона, вызывая перекисное окисление липидов и увеличение токсического эффекта свободных радикалов кислорода. Связываясь с тубулином микротрубочек, ацетальдегид блокирует секрецию белков. Увеличение количества белка, липидов, воды и электролитов вызывает увеличение размеров гепатоцитов. Ацетальдегид-белковые аддукты способствуют производству коллагена и могут действовать как неоантигены, которые стимулируют иммунный ответ. Этанол подавляет синтез восстановленного глутатиона, потеря этого соединения в митохондриях печени способствует повреждению органелл гепатоцитов и снижению их эффективности в отношении утилизации ксенобиотиков [21, 22]. Ацетилцистеин был первоначально запатентован в 1960 году и лицензирован для использования в 1968 году. Он включен в Список основных лекарственных средств ВОЗ, наиболее эффективных и безопасных лекарств, необходимых в системе здравоохранения в качестве препарата применяемого при передозировке парацетамола и для проведения муколитической терапии [23]. Это соединение выступает в роли предшественника L-цистеина, из которого образуется антиоксидант глутатион. Глутатион содержит пептидную связь между аминогруппой цистеина и карбоксильной группой боковой цепи глутамата. Значение глутатиона в клетке определяется его антиоксидантными свойствами. Фактически глутатион не только защищает клетку от токсичных свободных радикалов, но и в целом определяет окислительно-восстановительные характеристики внутриклеточной среды. В клетке тиоловые группы находятся в восстановленном состоянии в концентрации около 5 ммоль/л. Фактически такая высокая концентрация глутатиона в клетке приводит к тому, что он восстанавливает любую дисульфидную связь, образующуюся между остатками цистеина внутриклеточных белков. Это сопровождается окислением восстановленной формы глутатиона. Восстанавливается окисленный глутатион под действием фермента глутатионредуктазы, который постоянно находится в клетке в активном состоянии и индуцируется при окислительном стрессе. Соотношение восстановленной и окисленной форм глутатиона в клетке является одним из важнейших параметров, который определяет уровень окислительного стресса, который нарастает в период употребления алкоголя и развития похмелья [22, 24]. Введение ацетилцистеина способствует пополнению запасов глутатиона, который не только выполняет важнейшую функцию по обезвреживанию активных форм кислорода, но и вместе с окисленным глутатионом и S-нитрозоглутатионом связывается с сайтом распознавания глутамата рецепторов NMDA и AMPA (через их γ-глутамильные фрагменты) и может являться эндогенным нейромодулятором. При миллимолярных концентрациях они также могут модулировать окислительно-восстановительное состояние рецепторного комплекса NMDA [25]. Глутатион модулирует рецептор NMDA, воздействуя на окислительно-восстановительный сайт. L-цистеин также служит предшественником цистина, который, в свою очередь, служит субстратом для антипортерацистин-глутамата на астроцитах, следовательно, увеличивает выброс глутамата во внеклеточное пространство, где он действует на рецепторы mGluR 2/3, а при более высоких дозах ацетилцистеина - mGluR 5 [26], что важно, поскольку похмельный сидром сопровождается депрессией нейромедиаторов, восстановление баланса которых может способствовать скорейшему восстановлению нейрокогнитивных функций. Ацетилцистеин оказывает некоторые противовоспалительные эффекты, возможно, посредством ингибирования транскрипционного фактора NF-κB и модуляции синтеза цитокинов [27]. Основываясь на данных, полученных в доклинических и ограниченных клинических исследованиях, ацетилцистеин, по-видимому, нормализует нейротрансмиссию глутамата в прилежащее ядро и другие структуры мозга, частично за счет усиления экспрессии возбуждающего переносчика аминокислот 2, известного как переносчик глутамата 1 у лиц с зависимостью. У взрослых людей с кокаиновой зависимостью ацетилцистеин модулирует нейротрансмиссию глутамата, чего не наблюдается у людей без зависимости [28]. Это исследование, в совокупности с представленными данными, позволяет предположить, что применение ацетилцистеина с целью улучшения самочувствия при похмелье может оказывать двойное действие, с одной стороны облегчая метаболизм ксенобиотиков в печени, а с другой оказывая нейропротекторное и активирующее действие, способствуя снижению тяги к алкоголю. Ацетилцистеин, действующий как модулятор нейротрансмиссии глутамата и дофамина, обладающий выраженным антиоксидантным эффектом, представляет собой перспективное соединение для дальнейшей разработки лекарственных средств, предназначенных для коррекции постинтоксикационного состояния, вызванного употреблением высоких доз этанола. ЗАКЛЮЧЕНИЕ На фоне острой алкогольной интоксикации введение ацетилцистеина, способствует восстановлению содержания глутатиона в печени и приводит к снижению выраженности нарушений психоневрологических и когнитивной функций у экспериментальных животных. Результаты исследования указывают на перспективность применения ацетилицистеина с целью устранения выраженности похмельного синдрома.

About the authors

D. V. Kurkin

Volgograd State Medical University

Email: strannik986@mail.ru

E. I. Morkovin

Volgograd State Medical University

Email: e.i.morkovin@gmail.com

N. A. Osadchenko

Volgograd State Medical University

Email: n.a.osadchenko@gmail.com

L. P. Knyshova

Volgograd State Medical University

Email: knyshova-liliya@inbox.ru

D. A. Bakulin

Volgograd State Medical University

Email: mbfdoc@gmail.com

E. E. Abrosimova

Volgograd State Medical University

Email: abrosimiva.volgmed@gmail.com

Yu. V. Gorbunova

Volgograd State Medical University

Email: yvgorbunova@yandex.ru

I. N. Tyurenkov

Volgograd State Medical University

Email: fibfuv@mail.ru

References

Supplementary files