Antiulcer activity of 2-phenyl-9-diethylaminoethylimidazo[1,2-a]benzimidazole dinitrate in ethanol-prednisolone damage to gastric mucosa

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Поиск новых эффективных и безопасных лекар- ственных средств для лечения кислотозависимых заболеваний желудочно-кишечного тракта до насто- ящего времени остаётся актуальным вопросом фар- макологии [1, 2]. Химические соединения из группы производных бензимидазола представляются пер- спективными в плане разработки новых лекарствен- ных препаратов, в том числе связанных с повышени- ем кислотопродукции в желудке [3, 4]. В настоящее время проводятся доклинические исследования производного бензимидазола, а имен- но динитрата 2-фенил-9-диэтиламиноэтилимида- зо[1,2-а]бензимидазола, демонстрирующего антисе- креторный, противоязвенный и гастропротективный эффекты на моделях экспериментальных патологи- ческих состояний у лабораторных животных, связан- ных с различными патогенетическими механизмами ульцерогенеза в слизистой оболочке желудка (СОЖ) [5-7]. Известно, что одним из механизмов формирова- ния язвенной болезни желудка является разобщение гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы регуляции функций, вызванное хроническим стрес- сом. В частности, повышенный уровень глюкокор- тикоидов, вызывающих усиление катаболических процессов, подавляющих регенерацию, нарушаю- щих микроциркуляцию и стимулирующих секрецию соляной кислоты, на фоне ишемии стенки желудка, провоцируют ульцерогенез [8, 9]. При этом в условиях экспериментального иссле- дования модель язвообразования, обусловленная действием синтетического глюкокортикоида пред- низолона в чистом виде характеризуется низкой воспроизводимостью и в связи с этим была исполь- зована модификация модели, предлагающая исполь- зование сочетания преднизолона с 80% спиртом [10]. Этанол способствует растворению защитного слизистого барьера, делая стенку желудка уязвимой для повреждения протеолитическими и кислотными факторами. Кроме этого, этанол снижает кровоток, повреждает эндотелий сосудов, разбалансирует кле- точную антиоксидантную защиту, стимулируя фор- мирование супероксиданион и гидроперекисных радикалов [11]. Таким образом, сочетание этанола и преднизо- лона позволяет воссоздать эрозивно-язвенные де- фекты СОЖ с высокой (100%) статистической вероят- ностью. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - экспериментальное исследование противоязвенной активности субстан- ции динитрата 2-фенил-9-диэтиламиноэтилимида- зо[1,2-а]бензимидазола на модели повреждения СОЖ, вызванной введением комбинации 80% этано- ла и преднизолона (20 мг/кг). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Животные Исследование фармакологической активно- сти было выполнено на аутбредных крысах-самцах Wistar (возраст 10-12 недель) массой 180-250 г, по- лученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» (д. Рапполово, Ленинградская обл.). На время проведения исследования крысы содержа- лись в стандартных условиях вивария при температу- ре воздуха 22±2°С, относительной влажности 60±5% и естественной смене суточного цикла. Экструдиро- ванный корм и воду водопроводную крысы получа- ли ad libitum. Разброс по исходной массе животных в группе не превышал 10% [12]. Условия содержания животных соответствовали требованиям постановления Главного государствен- ного санитарного врача РФ от 29.08.2014 №51 «Об утверждении СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидеми- ологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)». Манипуляции с экспериментальными живот- ными выполнялись в соответствии с общеприняты- ми этическими нормами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, ис- пользуемых для экспериментальных и иных научных целей (1986) и с учетом Международных рекоменда- ций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997) [13, 14]. Дизайн исследования Субстанция динитрата 2-фенил-9-диэтиламино- этилимидазо[1,2-а]бензимидазола синтезирована в Научно-исследовательском институте физической и органической химии ФГАОУ ВО «Южный федераль- ный университет» (г. Ростов-на-Дону). Оценка противоязвенного действия субстанции, проводилась в дозах 3 мг/кг, 10 мг/кг и 30 мг/кг. В качестве объектов сравнения были использованы субстанция омепразола 0,3 мг/кг, 1 мг/кг и 3 мг/кг (Sigma Аldrich, США), и субстанция ранитидина 3 мг/ кг, 10мг/кг и 30 мг/кг (Sigma Аldrich, США). Максимальный объем для внутрижелудочного введения крысам не превышал 3 мл для животных массой до 200 г, 5 мл для животных от 200 до 240 г. и 6 мл для животных массой более 240 г. Язвенное поражение вызывалось введением преднизолона из расчета 20 мг/кг и 80% этилового спирта в дозе 0,6 мл на 100 г массы тела животных. Преднизолон растворяли в 80% спирте. За 24 часа до моделирования патологии живот- ные подвергались пищевой депривации со свобод- ным доступом к воде. В ходе экспериментального исследования жи- вотные были разделены на 10 групп по 10 особей в каждой. Контрольная группа получала комбинацию этанола и преднизолона внутрижелудочно однократ- но. Изучаемое производное бензимидазола и препа- раты сравнения вводились за 1 час до введения ком- бинации этанола и преднизолона в опытных группах. Эвтаназию животных проводили через 12 часов по- сле введения комбинации этанола и преднизолона. После вскрытия брюшной полости желудки изыма- лись, промывались физиологическим раствором, проводилась макроскопическая оценка состояния слизистой оболочки, ткани фотографировались (ма- крофотография). Для гистологических исследований желудок фиксировался в 10%-ном нейтральном фор- малине и заливался парафином. Затем с помощью санного микротома изготавливались срезы, которые окрашивались гематоксилин-эозином и изучались под микроскопом с последующим описанием гисто- логической картины, оценкой глубины поражения стенки желудка. Микрофотосъемку производили с помощью микроскопа LeicaDM 1000 и программного базово- го пакета "Leica Application Suite" (Leica, Германия). Морфометрическое исследование проводилось с использованием инструментов программного обе- спечения "Leica Application Suite", где определялась глубина повреждения слизистой оболочки желудка. Определяемые показатели Для оценки тяжести повреждения при исследо- вании противоязвенного действия при моделирова- нии всех патологических состояний применяли си- стему баллов [15]. В каждой группе подсчитывали сумму баллов, из которой выводили среднюю арифметическую ве- личину, характеризующую среднюю степень изъяз- вления в группе. Кроме того, в группе рассчитывали индекс изъязвления. В индексе изъязвления отра- жены как процент частоты животных с язвами, так и степень дистрофических нарушений в желудке. При гистологическом исследовании оценивали глубину повреждения. По результатам исследования рассчитаны вели- чины ЕД50 для субстанции производного бензими- дазола и ранитидина, так как они использовались в одинаковых дозах. ЕД50 для омепразола не опреде- лялось, так как данное вещество имеет другой поря- док используемых доз и сравнение значений ЕД50, как критерий оценки эффективности некорректен. Статистическая обработка Полученные экспериментальные данные анали- зировались с использованием метода вариационной статистики. В итоговых таблицах представлены сред- ние значения по группе (М) и стандартная ошибка среднего значения (m). Межгрупповые различия анализировались с помощью непараметрического критерия - U-критерий Манна-Уитни. Различия опре- делялись при 0,05 уровне значимости. Для статисти- ческой обработки результатов использовали пакет программ «StatPlus 2009». РЕЗУЛЬТАТЫ Макроскопически данная модель воспроизводит язвенные дефекты, затрагивающие значительную площадь СОЖ, при этом явно выражены как эрозив- ные, так и язвенные повреждения вплоть до некро- тических. Полученные результаты экспериментальных исследований показали, что производное бензими- дазола в дозах 3, 10 и 30 мг/кг способствует дозо- зависимому достоверному относительно контроля и препаратов сравнения (ранитидина и омепразо- ла) снижению площади язвенного поражения, СИ и ИИ на 35%, 74% и 91%, соответственно, при этом в дозе 30 мг/кг достоверно снижается доля животных с язвенными поражениями СОЖ на 60% (таблица 1). Ранитидин в дозе 10 и 30 мг/кг также вызывал достоверное относительно контроля снижение пло- щади язвенного поражения, однако с учетом баллов СИ и частоты проявления язвенных дефектов, умень- шение ИИ не превысило 38% и 44%, соответственно. Введение омепразола в дозах 1 и 3 мг/кг способство- вало достоверному относительно контроля сниже- нию площади язвенных дефектов, СИ и ИИ на 35% и 46%, соответственно, при этом доля животных с язвенными поражениями СОЖ как при введении ра- нитидина, так и омепразола достоверно не отлича- лись от контроля (таблица 1). Таким образом, на модели этанол-преднизоло- новых язв, производное бензимидазола оказало вы- раженный противоязвенный эффект, превосходящий результаты в группах, получавших ранитидин и оме- празол, в среднем в 2 раза. Расчетное значение ЕД50 для производного бен- зимидазола составило 5,09 мг/кг, ЕД50 для ранитиди- на - 38,23 мг/кг. На рисунке 1 представлена наиболее типичная макроскопическая картина СОЖ, на фоне действия изучаемой субстанции производного бензимидазо- ла в сравнении с ранитидином и омепразолом при моделировании этанол-преднизолоновых язвенных поражений. Гистологические исследования показали, что комбинация этанола с преднизолоном вызывает развитие обширных поверхностных дефектов СОЖ с внушительными зонами эозиновых масс, затрагива- ющих подслизистую основу, выраженной лейкоци- тарной инфильтрацией, кровоизлияниями и некро- зом тканей (рис. 2). Производное бензимидазола способствовало до- зозависимому снижению степени повреждения сли- зистой оболочки, уменьшению отека, кровоизлияний, некроза и деструкции кровеносных сосудов (рис. 2). Ранитидин и омепразол на данной модели по- вреждения проявили значительно менее выражен- ный протекторный эффект. Частоты повреждений, достигающих подслизистой основы, некрозов, де- струкций желез и кровоизлияний в слизистой обо- лочке были сравнимы с контролем (рис. 3). Результаты морфометрических исследований свидетельствуют, что субстанция производного бен- зимидазола в дозах 3, 10 и 30 мг/кг способствовала достоверному относительно контроля и препаратов сравнения снижению глубины повреждения на 38%, 42% и 71%, соответственно (таблица 2), значительно превосходя при этом ранитидин и омепразол. ОБСУЖДЕНИЕ Механизм повреждающего действия глюкокорти- коидов на СОЖ заключается в снижении резистентно- сти защитного барьера за счет подавлении синтеза про- стагландинов, которые оказывают гастропротективный эффект, а также за счет угнетения активности пероксида- зы, что приводит к повышению уровня H2 O2 и, соответ- ственно, уровня гидроксильных радикалов, что в свою очередь усиливает повреждение СОЖ соляной кисло- той, секретируемой париетальными клетками желуд- ка [16]. Глюкокортикоиды также замедляют процессы репарации и регенерации СОЖ за счет ингибирования ангиогенеза [17], подавления EGF-стимулированной пролиферации клеток эпителия СОЖ, при этом одним из путей является угнетение активации ERK1/ERK2 с по- следующим подавлением ЦОГ-2 и снижением экспрес- сии Циклина D1 и синтеза ДНК [18]. Этанол, в свою оче- редь, способствует растворению защитного слизистого барьера, снижает кровоток, повреждает эндотелий со- судов, стимулирует формирование супероксиданион и гидроперекисных радикалов [11]. Исследуемая фармацевтическая субстанция ди- нитрата 2-фенил-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а] бензимидазола продемонстрировала выраженный дозозависимый противоязвенный эффект при моде- лировании повреждения СОЖ, вызванным сочетани- ем 80% этанола и преднизолона, регистрируемый как на макро-, так и на микро морфологическом уровнях, снижая площадь и степень повреждения СОЖ, умень- шая отек, интенсивность кровоизлияний, некроза и деструкции кровеносных сосудов, при этом получен- ные данные согласуются с результатами ряда пред- шествующих исследований, свидетельствующими о наличии противоязвенного и гастропротективного эффектов в условиях воспроизведения геликобактеро- подобных повреждений СОЖ у крыс, моделируемых 1 2 3 4 5 6 Рисунок 3 - Микрофотографии слизистой оболочки желудка крыс при моделировании эрозий, вызванной введением комбинации 80% этанола и преднизолона (20 мг/кг) на фоне введения препаратов сравнения Примечание: 1 - Ранитидин 3 мг/кг, 2 - Омепразол 0,3 мг/кг, 3 - Ранитидин 10 мг/кг, 4 - Омепразол 1 мг/кг, 5 - Ранитидин 30 мг/кг, 6 - Омепразол 3 мг/кг внутрижелудочным введением аммиака в сочетании с острой дозированной кровопотерей [5] и иммобили- зационным стрессом [6]. Противоязвенное действие субстанции производного бензимидазола может быть связано с несколькими механизмами. Во-пер- вых, за счет выраженного антисекреторного эффекта, проявляющегося подавлением секреции HCl, как ба- зальной, так и в условиях стимуляции гистамином [7], который приводит к уменьшению кислотности желу- дочного содержимого и, соответственно, снижению его ульцерогенного потенциала. Во-вторых, в связи с вероятной антиоксидантной активностью, которая по- казана в ряде работ по исследованиям биологической активности производных бензимидазола [19-21], что, однако, требует дополнительного изучения. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные экспериментальные данные свиде- тельствуют о том, что производное бензимидазола оказывает выраженный дозозависимый противо- язвенный эффект на модели этанол-преднизолоновых эрозивно-язвенных дефектов СОЖ, в среднем в 2 раза превосходящий эффекты препаратов сравнения. Результаты исследований согласуются с ранее полученными данными об антисекреторной и про- тивоязвенной активности динитрата 2-фенил-9-ди- этиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола, и, учитывая уровень антиульцерогенного эффекта, превышающий таковой у препаратов сравнения, ши- роко используемых в клинической практике Н2 -ги- стаминоблокатора ранитидина и ингибитора водо- родно-калиевой АТФ-азы омепразола, позволяют считать перспективным дальнейшее изучение фар- макологических эффектов данного соединения, с целью создания нового антисекреторного, противо- язвенного препарата.

About the authors

M. V. Chernikov

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

Email: pharmax@list.ru

M. A. Oganova

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

Email: marina-oganova81@mail.ru

S. A. Kalashnikova

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

Email: kalashnikova-sa@yandex.ru

L. V. Polyakova

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

Email: lypolyakova7@gmail.ru

N. A. Khromova

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

Email: khromovanatasha1994@gmail.com

References

Supplementary files