Molecular selection of Beta vulgaris L. breeding materials with genes of resistance to abiotic stresses

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

In the work, the results of sugar beet breeding materials' molecular-genetic studying for presence of genes of resistance to root-knot nematode, rhizomania and powdery mildew are presented. Testing of plants was conducted using polymerase chain reaction method. The genes R6m-1, Rz1 and Rz2, Pm were identified with the help of 5 one-chain RAPD and 4 allele-specific primers. Aim of the studies is to screen sugar beet varieties for presence of the abovementioned genes of resistance. Domestic and foreign sugar beet hybrids were an object of the studies.

Full Text

Сахарная свекла, как и другие культуры, подвержена воздействию биотических и абиотических факторов среды. Данную культуру поражают преимущественно свекловичная нематода, представитель вида Heterodera schachtii Schmidt, а также около 6 видов галловых нематод рода Meloidogyne ssp., которые вызывают в основном корневое угнетение [1]. Для выявления локусов, связанных с устойчивостью/ чувствительностью к галловой и свекловичной нематодам, были применены методы картирования генома с использованием RFLP, RAPD, SSR и SNP маркеров [2-4]. Основными источниками устойчивости служат дикие виды свеклы. Ранее устойчивость к нематодам идентифицирована у приморской свеклы, затем она была интрогрессирована в сахарную свеклу (Beta vulgaris L.), в которую ген устойчивости перенесен путем гибридизации с устойчивыми видами Beta vulgaris ssp. maritima, Beta procumbens и Beta patellaris и возвратными скрещиваниями [5]. В потомство F1 устойчивость передается согласно законам расщепления классической теории наследования, так как обеспечивается деятельностью однокопийного доминантного гена, названного R6m-1. Установлена эффективность действия этого моногена против патогенного влияния 6 различных представителей рода Meloidogyne spp. [6]. При наличии данного гена обеспечивается высокий уровень экспрессии защитных белков – ингибиторов протеиназ, с помощью которых вредитель разрушает клеточную оболочку растений. Исследования группы иранских ученых [2] по поиску локализации гена устойчивости привели к конструированию аллельспецифичных праймеров Nem06, NEM06 и nem06, соответствующих локусам, сцепленным с геном устойчивости к корневым нематодам (R6m-1).

Достаточно вредоносная болезнь сахарной свеклы – мучнистая роса. Впервые ген устойчивости к мучнистой росе был выявлен у диких видов Beta v. ssp. maritima WB 97 и WB 242 и обозначен как Pm. Устойчивость носила моногенный характер и успешно передавалась культурным видам при скрещивании [7]. Устойчивость, обусловленная экспрессией одного гена, установлена и у других видов растений, в частности, у культурных сортов пшеницы. И в этом случае доминантный ген был привнесен из диких форм злака [8, 9]. Однако при более детальном изучении процессов расщепления селекционного материала сахарной свеклы выявлен также и полигенный (QTL) характер устойчивости к мучнистой росе [10]. Пять основных доминантных генов устойчивости были идентифицированы и обозначены как Pm2, Pm3, Pm4, Pm5 и Pm6. Экспрессия одних генов обозначала полную устойчивость к мучнистой росе; проявление других генов обеспечивало частичную устойчивость. При помощи SNP-картирования у сахарной свеклы определены доминантные гены, локализованные на 2 и 4 хромосомах и к ним подобраны специфические SNP маркеры [11]. Метод классической полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет выявить доминантный R-ген Pm у сахарной свеклы.

Сахарная свекла поражается и вирусами. Наиболее известная и экономически ощутимая болезнь – ризомания, возбудителем которой служит вирус некротического пожелтения жилок свеклы (ВНПЖС). Это многокомпонентный вирус с разделенным геномом в виде 4-5 РНК, каждой из которой отведена роль в репродуцировании и трансляции наследственной информации [12]. Переносчик вируса – почвенный гриб Polymyxa betae. В США в 1983 г. был идентифицирован доминантный ген устойчивости Holly [13]. Было показано, что резистентность / чувствительность генотипов определяется наличием/отсутствием одного или двух из пяти генов с варьирующей экспрессивностью в гетерозиготном состоянии. Гены Rz1, Rz2, Rz3, Rz4 и Rz5 локализованы на хромосоме III; Rz1, Rz4 и Rz5 – аллели одного и того же гена. Гены устойчивости Rz2 и Rz3 отдельно или в комбинации могут предотвратить инфекцию ВНПЖС полностью, что позволяет отнести их к самостоятельным единицам. Выделены и секвенированы участки генома растений, локализованные и наследуемые вместе с генами устойчивости к вирусу НПЖС [14-16]. В связи с этим выявление генов устойчивости к биотическим стрессорам в селекционных образцах сахарной свеклы актуально и стало целью нашей работы.

Методика. В качестве материала для исследований на наличие генов устойчивости к описанным болезням использовали растения 6 гибридов сахарной свеклы отечественной и зарубежной селекции: H7581 – гибрид, Швеция; БО32 4Х (Белоцерковская односемянная 32, тетраплоид), Украина; P1537 (Рамонский, сахаристый сортотип), Россия; Z67-Z тип (сахаристый сортотип), Германия; Poli (церкоспороустойчивый сортотип), Болгария; 4HH25 – гибрид, США.

Для проведения экспериментов осуществляли экстракцию тотальной ДНК из растительной ткани с применением 8 М ацетата аммония, протеиназы К и 20% SDS [17, 18]. Качество выделенной ДНК определяли электрофорезом в 1,5%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Полученную ДНК, растворенную в 10 мМ трис-НCl-буфере, содержащем 0,1 мМ ЭДТА, использовали для ПЦР-анализа. ПЦР осуществляли на амплификаторе «Genius» (Великобритания).

Для проведения амплификации были подобраны следующие параметры: предварительная денатурация: 940С в течение 5 мин, 33-40 циклов: 940С – 30 с, отжиг – 30 с; 720С – 60 с; финальный этап элонгации цепи: 720С – 5 мин. Визуализация ПЦР-фрагментов проходила под УФ-лучами в трансиллюминаторе Vilber.

Тестирование растений на наличие генов устойчивости к ризомании проводили с помощью следующих одноцепочечных RAPD-праймеров [19]: 1 – OP-AN9:5/-

GGGGGAGATG-3/, 2 – AB2-2:5/-TGCCGGCTTC-3/, 3 – АB3-3:5/-TCTCCGCTTG-3/, 4–АB6-15:5/-AGTCGCCCTT3/, 5 – B9-3: 5/AGCCAGGCTG-3/.

Идентификацию гена устойчивости к корневым нематодам осуществляли при помощи следующего аллель-специфичного праймера [2]: Nem06 F 5, TGCCGAGCTGCTTGACGGGTTGTC– 3,, Nem06 R 5, GTTTCGCTCCTCAGAATTGCTGAAG – 3,. Гомо- и гетерозиготность исследуемых образцов также устанавливали аллель-специфичными праймерами [2]: nem06 F 5, -TGACGGGTTGTCAATATGC– 3,, nem06 R 5, TCCATTTCCTGACCTACAATTATT– 3,, NEM06 F 5, AAAGAAAGGGAACTCAAATGTTAG – 3,, NEM06 R 5, TCAGAATTGCTGAAGGTCATT– 3,.

Идентификацию гена устойчивости к мучнистой росе осуществляли при помощи следующего праймера: Pm36 F:5/-GGCACTTACAAGATACCGAACT-3/ и Pm36R:5/-ACTTAGCAGGCATTACCGCA-3/.

Результаты и обсуждение. Для профилактики инфицирования нематодами при посеве сахарной свеклы целесообразно использовать формы, устойчивые к этой болезни. Амплификацию ДНК растений на наличие генов устойчивости к нематодам проводили с использованием аллель-специфичного праймера Nem 06 F/R. Применение ПЦР позволило установить, что не у всех тестируемых гибридов сахарной свеклы выявлены гены устойчивости к галловой нематоде (рис. 1).

 

Рис. 1. Электрофореграмма разделения ПЦР-продуктов с использованием праймера Nem06 F/R. Дорожки (образцы сахарной свеклы): 1 – Н7581, Швеция; 2 – БО32 4Х, Украина; 3 – Р1537, Россия; 4 – Z67-Z-тип, Германия; 5 – Poli, Болгария; 6 – 4HH25, США. М – маркер молекулярных масс (Сибэнзим), 100-3000 п.н., К – отрицательный контроль (ПЦР – смесь без ДНК).

 

Только у четырех образцов растений идентифицирован ампликон длиной 600 п.н. (пар нуклеотидов), характерный для гена R6m-1 (первый образец – Швеция, H7581; второй – Украина, Белоцерковская односемянная 32, тетраплоид; третий – Россия, Р1537; четвертый – Болгария, Poli).

Далее с использованием четырех образцов был проведен эксперимент по установлению в них гомозиготных аллелей по этому гену. ПЦР-амплификация не выявила ампликонов длиной 555 и 478 п.н., характерных для устойчивых гомозигот. Это свидетельствует о том, что все генотипы оказались гетерозиготами. Следовательно, при дальнейшем расщеплении селекционный материал образует гаметы с доминантными и рецессивными аллелями в соотношении 4:1 [6].

Тестирование растений на наличие гена устойчивости к мучнистой росе проводили с использованием праймера Pm36 F/R. В связи с этим для первичного отбора относительно устойчивого к мучнистой росе селекционного материала мы использовали специфический праймер к локусу Pm36, разработанный нами в системе BLAST, на основе информации международной базы данных биологических публикаций PubMed (NCBI). Этот ген находится на хромосоме 2 и кодирует один из рецепторных бифункциональных TENA-E белков, участвующих в распознавании патогена и активации нисходящих путей защиты в ответ на биои абиотические стрессы.

Проведение ПЦР с данным молекулярным маркером позволило четко выявить локусы с характерными для них ДНК-фрагментами молекулярной массой 1000 п.н. у 3 образцов сахарной свеклы (Н7581, Швеция;    2 – БО32 4Х, Украина; 3 – Р1537, Россия) (рис. 2).

 

Рис. 2. Электрофореграмма разделения ПЦР-продуктов с использованием праймера Pm36 F/R. Дорожки (образцы сахарной свеклы): 1 – Н7581, Швеция; 2 – БО32 4Х, Украина; 3 – Р1537, Россия; 4 – Z67-Z-тип, Германия; 5 – Poli, Болгария; 6 – 4HH25, США. М – маркер молекулярных масс (Сибэнзим), 100-3000 п.н. К -– отрицательный контроль (ПЦР – смесь без ДНК).

 

Селекционный материал сахарной свеклы, исследуемый на наличие локусов, связанных с устойчивостью к ризомании, тестировали RAPD-маркерами. Использовали 5 одноцепочечных дека-праймеров: АВ 6-15, ОР-АN9, сцепленные с геном Rz1 и АВ 2-2, АВ 3-3, АВ 9-3, сцепленные с геном Rz2. Наиболее насыщенными по количеству идентифицированных аллелей оказались локусы, обнаруженные при помощи праймеров АВ 6-15 и АВ 2-2.

Так, амплификация с праймером АВ 6-15 позволила выявить по 3 ампликона у всех образцов размером 100, 400 и 2000 п.н. Номера 2 и 3 (БО32 4Х, Украина; Р1537, Россия) характеризовались наличием 4 ПЦР-продуктов (100,  300,  400  и  2000  п.н.).  Образец  4   (Z67-Z-тип,

Германия) содержал 5 ампликонов (100, 300, 400, 1500 и 2000 п.н.) на локус (рис. 3).

Амплификация с праймером АВ 2-2 позволила выявить 3 ПЦР-фрагмента у номеров 1, 2 и 4 (300, 500 и 1000 п.н.), по 2 ампликона – у образцов 3, 5 и 6 размером 300 и 1000 п.н. на локус. Применение ПЦР с RAPDпраймером OP-AN9 позволило установить у всех тестируемых гибридов локусы, находящиеся в зоне локализации гена устойчивости Rz1 (рис. 4). У 3 образцов растений идентифицированы по 3 ампликона длиной 100, 200 и 700 п.н. Номера 4, 5 и 6 имели один ПЦР продукт длиной 200 п.н.

 

Рис. 3. Электрофореграмма разделения ПЦР-продуктов с использованием праймера АВ 6-15. Дорожки (образцы сахарной свеклы): 1 – Н7581, Швеция; 2 – БО32 4Х, Украина; 3 – Р1537, Россия; 4 – Z67-Z-тип, Германия; 5 – Poli, Болгария; 6 – 4HH25, США. М – маркер молекулярных масс (Сибэнзим), 100-3000 п.н.

 

Рис. 4. Электрофореграмма разделения ПЦР-продуктов с использованием праймера ОЗ-АN9. Дорожки (образцы сахарной свеклы): 1 – Н7581, Швеция; 2 – БО32 4Х, Украина; 3 – Р1537, Россия; 4 – Z67-Z-тип, Германия; 5 – Poli, Болгария; 6 – 4HH25, США. М – маркер молекулярных масс (Сибэнзим), 100-3000 п.н.

 

Амплификация с праймером АВ 9-3 позволила выявить по 3 ПЦР-фрагмента у номеров 1, 2, 3, 4 и 5 (100, 300 и 500 п.н.) и по 2 ампликона – у образцов 3, 5 и 6 (300 и 1000 п.н.). Исключением был образец под номером 6 (4НН25, США), у которого ампликоны, соответствующие спектру праймера АВ 9-3, не обнаружены. У образца под номером 6 при проведении ПЦР-анализа с праймером АВ 3-3 также не выявлено ДНК-фрагментов, соответствующих искомому локусу. Все другие номера характеризовались наличием одного ампликона длиной 700 п.н.

Таким образом, применяемый нами подход при скрининге гибридов сахарной свеклы на устойчивость к нематоде, ризомании и мучнистой росе с использованием специфических и одноцепочечных RAPDпраймеров можно успешно использовать в селекционной практике. Выделены 4 образца растений сахарной свеклы (Украина, Россия, Швеция, Болгария), несущие гены устойчивости к галловой нематоде (R6m-1), 6 – к ризомании (Rz1 и Rz2), 3 (Украина, Россия, Швеция) – к мучнистой росе (Pm36). Эти растения можно рекомендовать для использования как исходный материал при селекции на устойчивость к болезням.

Результаты проведенных ПЦР-анализов свидетельствуют о необходимости дальнейших молекулярногенетических исследований для отбора форм сахарной свеклы с повышенной устойчивостью к болезням с целью оптимизации селекционного процесса в целом. Для более точной классификации генотипов сахарной свеклы (устойчивые/чувствительные) будет проведено дальнейшее изучение селекционного материала этой культуры на экспрессию данных генов с использованием ДНК-маркеров нового поколения (SNP) и с применением генетического секвенирования.

×

About the authors

A. A. Nalbandyan

State Research Organization The A.L. Mazlumov All-Russian Research Institute of Sugar Beet of Russian Agricultural Academy

Author for correspondence.
Email: arpnal@rambler.ru

кандидат биологических наук

Russian Federation, 86, VNIISS, Ramonsky district, Voronezh region, 396030

T. P. Fedulova

State Research Organization The A.L. Mazlumov All-Russian Research Institute of Sugar Beet of Russian Agricultural Academy

Email: arpnal@rambler.ru

доктор биологических наук

Russian Federation, 86, VNIISS, Ramonsky district, Voronezh region, 396030

A. S. Hussein

State Research Organization The A.L. Mazlumov All-Russian Research Institute of Sugar Beet of Russian Agricultural Academy

Email: arpnal@rambler.ru

кандидат биологических наук

Russian Federation, 86, VNIISS, Ramonsky district, Voronezh region, 396030

References

  1. Yu M.H. Root-Knot Nematode Develop-ment and RootGall Formation in Sugar Beet // Journal of Sugar Beet Research. – 1995. – V. 32. – №1. – P. 47-58.
  2. Bakooie M., Pourjam E., Mahmoudi S., Safaie N., Naderpour M. Development of an SNP Marker for Sugar Beet Resis-tance/Susceptible Genotyping to Root-Knot Nematode // J. Agr. Sci. Tech. – 2015. – Vol. 17. – P. 443-454.
  3. Gai D., Kleine M., Kifle S., Harloff H. Positional cloning of a gene for nematode resistance in sugar beet // Science. – 1997. – V. 275. – P. 832-834.
  4. Stevanato P., Trebbi D., Panella L., Richardson K., Broccanello C. Identification and Validation of a SNP Marker Linked to the Gene HsBvm-1 for Nematode Resistance in Sugar Beet // Plant Mol Biol Rep. – 2015.– V. 33. – P. 474-479.
  5. Klein M., Voss H., Gai D., Jung C. Evalution of nematode-resistance sugar beet (Beta vulgaris L.) lines by molecular analysis // Theor. Appl. Genet. – 1998. – V. 97. – P. 896-904.
  6. Weiland J., Yu M. A Cleaved Amplified Polimorphic Sequence (CAPS) Marker Associated with Root-Knot Nematode Resistance in Sugarbeet // Crop Sci. – 2003. – V. 43. – P. 1814-1818.
  7. Lewellen R., Schrandt J. Inheritance of Powdery Mildew Resistance in Sugar Beet Derived from Beta vulgaris subsp. maritima // Plant Disease. – 2001. – V.85. – № 6. – P. 627-631.
  8. Blanco A., Gadaleta A., Cenci A., Carluccio A., Abdelbacki A., Simeone R. Molekular mapping of the novel powdery mildew resistance gene Pm36 introgressed from Triticum turgidum var. dicoccoides in durum wheat // Theor Appl Genet. – 2008. – V. 117. – P. 135-142.
  9. Petersen S., Lyerly J., Worthihgton M., Parks W., Cowger C., Marshall D., Brown-Guedira G., Murphy J. Mapping of powdery mildew resistance gene Pm53 introgressed from Aegilops speltoides into soft red winter wheat // Theor Appl Genet. – 2015. – V. 128 (2). – P. 303-312.
  10. Janssen J., Nihlgard M., Kraft Th. Mapping of Resistance Genes to Powdery Mildew (Erysiphe betae) in Sugar beet // 1 joint IIRB-ASSBT Congress.2003. – USA. – P. 175-180.
  11. Grimmer M. K., Bean M. R., Asher M. J. C. Mapping of five resistance genes to sugar-beet powdery mildew using AFLP and anchored SNP markers // Theor. Appl. Genet. – 2007. – V.115. – P. 67-75.
  12. Tamada T. Susceptibility and resistance of Beta vulgaris subsp. maritima to foliar rub-inoculation with Beet necrotic yellow vein virus. // J. Gen Plant Pathology. – 2007. –V. 73. – P. 76-80.
  13. Lewellen R., Skoyen I., Erichsen A. Breeding sugar beet for resistance to rhizomania: evaluation of host-plant reaction and selections for and inheritance of resistance. // Proc. Of the 50th Winter Congress of the IIRB. – 1987. – P. 139-156.
  14. Capistano-Gossmann G., Ries D., Holtgrawe D., Minoche A., Kraft T., Frerichmann S., Soerensen T. Crop wild relative populations of Beta vulgaris allow direct mapping of agronomically important genes. // Nature Communication. – 2017. – V. 8. – P. 1-8. 15. Nouhi A., Amiri R., Hagh N., Saba Jalal, Mesbah M. Use of Molecular Marker for Assay Gene Dosage Resistant Gene to Rhizomania Disease (Rz1) in Sugar beet (Beta vulgaris L.). // Asian Journal of Biotechnology. – 2009. – V. 1. – P. 37-41.
  15. Litwinec A., Goska M., Kuzdowicz K., Lukanowski A., Skibowska B. Evaluation of rhizomania-resistance segregating sequences and overall genetic diversity pattern among selected accessions of Beta and Patellifolia. Potencial implications of breeding for genetic bottlenecks in terms of rhizomania resistance // Euphytica. – 2016. – V. 207. – P. 685-706.
  16. Hussein Fedulova Bogacheva A.S., Nalbandyan A.A., T.P., N.N. Efficient and nontoxic DNA isolation method for PCR analysis // Russian Agricultural Sciences. – 2014. – V. 40. – Issue 3. – Р. 177-178.
  17. Rogers S., Bendich A. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant Molecular Biologi. – 1985. – V. 5. – P. 67- 69. 17. Amiri R., Mesbah M., Moghaddam M. A new RAPD marker for beet necrotic yellow vein virus resistance gene in Beta vulgaris. // Biologia Plantarum. – 2009. – V. 53 (1). – P. 112-119.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2019 Russian Academy of Sciences

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies